06第六章_疫苗制造基本2010(新)学案.ppt

动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件更严格，控制难度更大，其培养方法可概括为： 静止培养法 悬浮培养法 转瓶培养法 细胞培养方法 固定化培养法 单层贴壁培养法 接种后，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面，然后进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。一般数天就长满整个表面，形成致密的单层细胞。 最后，贴壁培养的细胞会形成二种形态，成纤维样型细胞 fibroblast-like cell type 和上皮样型细胞 epithilium-like cell type 。 单层贴壁培养 monolayer anchoraged-dependent culture 是指把细胞贴附于一定的固体支持表面上进行的单层培养方法，这是是动物细胞培养的一种重要方法。 旋转培养是较期培养采用的细胞培养方法，目前仍用于疫苗等生产。 转瓶培养主要优点是：旋转培养简单，投资少，经济，可做成支架，大量培养，收获细胞或培养液方便，重复性好，容易放大。表面积增加，处于衡态转动，增加气体交换。 旋转培养（转瓶培养） 悬浮培养（Suspension culture）是指细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程，主要对于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞等。 动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的，经常借鉴发酵理论和经验，但有自身的特点，由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切，对环境适应性差，在悬浮培养中要注意发挥动物细胞的特性。 常用的反应器有通气式搅拌混合气升式生物反应器。方法的优点是操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。 悬浮培养法 固定化培养法 固定化培养（immobilization culture）是将动物细胞附着微载体或包埋胶囊内，即细胞固定化后，进行悬浮培养。适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养。具有细胞密度高、提高了抗剪切力和污染能力等优点，是生产首选方法。 吸附法 adsorption method 是通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面的一种固定化方法，如微载体培养和中空纤维培养等。虽然吸附法的操作过程简单，但由于相互作用弱，细胞容易从载体上脱落。 包埋法 entrapment method 是将细胞包埋在载体内部的一种固定化方法，分为网格型和微囊型两种。网格型的载体为高分子凝胶细网格，而微囊型的载体为高分子半透膜，直径为几至几百微米，比网格载体小得多。包埋细胞的高分子材料有人工合成的聚合物、琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等，最常使用的是海藻酸盐包埋非贴壁细胞和胶原包埋贴壁细胞。包埋的机理是通过物理作用而实现的，如1％～2.5％琼脂糖在高温加热下融化，低于45℃～37℃凝固，与细胞混合，分散在石蜡油中，降低至10℃，得到0.1～0.3 mm微球。 （四）接毒与收获 病毒接种培养有同步与异步之分，前者在细胞分装同时或不久接种毒种，进行培养，如猫、犬传染性肠炎疫苗 细小病毒 ；后者在细胞形成单层后接种毒种，如猪水疱病弱毒细胞培养疫苗。通常在细胞形成单层后倾去培养液，按1%-2%量接种毒种，经吸附后加入维持液继续进行培养，待出现70%-85%以上细胞病变时即可收获。 病毒培养液收获时间和方法依疫苗性质而定，可将培养瓶冻融数次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培养过程中可收获5-7次毒液，细胞毒液经无菌检验、毒价测定合格后供配苗用。 （五）配 苗 1．灭活疫苗 不同灭活剂对不同病毒的作用也不同。向细胞毒液内按规定加入灭活剂，在一定的温度下作用一定的时间，有的灭活剂还需加入阻断剂中止灭活。灭活疫苗配置通常都需加入佐剂，充分混合、分装，制成灭活疫苗。 2．冻干苗 细胞毒液内按比例加入保护剂或稳定剂，充分混合、分装，进行冷冻真空干燥制成冻于疫苗。 流程图3——病毒性细胞疫苗制造工艺流程 动物或胚胎 组 织 毒 株 种 毒 灭活病毒 消化 鉴定 培育 培养 检验 检验 配制 原 料 佐 剂 传代细胞 配 苗 （混匀、乳化） 灭活疫苗 细胞悬液 生长细胞 配 苗 活疫苗 保护剂 原 苗 分装、冻干 分 装 灭活 原 料 原 料 细胞培养液 配制 剪碎 种 子 鉴定 扩增 收获 配制 灭菌 * 其发展商史见表l。 第六章 疫苗制造基本程序 规疫苗主要是细菌性的菌苗、病毒性的疫苗和寄生虫疫苗三类，其制造程序、疫苗性质和免疫程序各不相同。 获得质量优良、安全的产品，关键环节如下： 1. 选择优良的菌种和毒种，并保持其稳定性； 2. 选用适当的培养繁殖细菌与病毒等微生物的方法，包括优良的培养基、合乎要求的最好是标准化的实验动物、禽胚及细胞； 3. 熟练掌握制品的生产工艺； 4. 准确掌握产品的检验方法和判定标准，严格按标准进行质量检定。 一、细菌性灭活疫苗制造 细菌性灭