13.ELISA原理学案.ppt

ELISA原理 陈时 ELISA历史： 70年代初期由荷兰学者VanWeeman与Schurrs和瑞典学者Engvall与PERLMARN等相继分别报道用酶来标记抗原或抗体的分析技术后，引起广泛重视。 由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA） ELISA应用 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。 ELISA法在生物医学各领域应用于四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 ELISA的理论基础 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术, ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 （1）抗原或抗体能物理性吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 ELISA方法 1、直接法 2、间接法 3、夹心法 4、竞争法 目前所应用检测体系：双抗体夹心法 双抗夹心法的建立 抗体组合的选择 包板抗体浓度的选择 酶标抗体的浓度选择 标准曲线的绘制 显色底物的选择及显色时间的控制 方法重复性与准确性验证 以TFI项目为例： 采用方阵滴定法选择合适的抗体包板浓度及酶标抗体使用浓度 标准曲线绘制 TFI的ELISA定量检测方法的确立 invitrogen，Mouse-anti-TNFRⅡ1ug/ml包板4℃过夜包被，二抗：PIERCE,HRP-goat-anti-Fc（1：10000）37℃孵育1h，1%BSA封闭1h，TianGEN TMB37℃显色15min,检测TFI。标准品梯度为300ng/ml，150ng/ml，75ng/ml，37.5ng/ml，18.75ng/ml，9.375ng/ml，4.6875ng/ml. 方法稳定性及准确性验证。 关于ELISA中应用的一些耦联酶 影响ELISA检测的因素 （1）要注意避免出现严重溶血血红蛋白中含有血红素基团其有类似过氧化物的活性因此在以HRP为标记酶的ELISA测定中如血清标本中血红蛋白浓度较高则其就很容易在温育过程中吸附于固相从而与后面加入的HRP底物反应显色 。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染一则细菌的生长其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰 。 （3）血清标本如是以无菌操作分离则可以在2～8℃下保存一周如为有菌操作则建议冰冻保存样本的长时间保存应在-70℃以下 。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用从而引起假阴性结果此外冻融标本的混匀亦应注意不要进行剧烈振荡反复颠倒混匀即可 。 ( 5 ) 抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质影响下，出现沉淀、凝集、的肉眼可见的反应，受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。 （6）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时应离心沉淀后取上清检测 。 免疫（Immunity） 免疫是一个医学概念：免疫是指机体对感染有抵抗能力，而不患疫病或传染病。 抗原与抗体 抗原（antigen，Ag）：能够和免疫应答产物（抗体及免疫细胞抗原受体）相结合的物质。 免疫原（immunogen）：能够使机体产生体液免疫和细胞免疫的物质叫免疫原。 半抗原（hapten）：只具有抗原性而无免疫原性，半抗原可以和抗体结合却不能单独诱 发免疫应答。 抗体（antibody，Ab）：机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞