第七章抗原抗体反应分解.ppt

第七章 抗原抗体反应 授课要点： 1. 抗原抗体反应原理 2. 常见的免疫分析方法 免疫应答的最终结果是免疫应答效应物与抗原性异物相互作用， 其结果或是保护机体免遭抗原性异物的损伤(生理性)，或是对自身组织器官造成损伤(病理性)。免疫效应物包括抗体、致敏淋巴细胞 、补体及其某些细胞因子。由于抗体存在天血清或组织液中，抗原抗体特异性反应不仅可在体内进行，也可在体外进行；所以抗原抗体反应就构成了利用血清学方法进行各种检测的基础。 第一节 抗体的制备 抗原抗体是血清学反应的物质基础，且对抗原特异性的抗体是免疫应答的效应物之一。所以，抗原的获得与纯化是获得特异性抗 体的先决条件(反过来，所得到的抗体又可以纯化和检测抗原)。抗原以不同形式和方式刺激机体免疫系统产生以抗体为主的体液免疫应答或以细胞毒为主的细胞免疫应答。抗原种类繁多，但依其物理性状可分为颗粒性和可溶性抗原两类。颗粒性抗原多为微生物细胞(或病毒粒子)；其制备相对简单，一般用新鲜细胞经无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤后，配制成一定浓度即可。若是细菌H-抗原，则还需用0.3-0.4%甲醛处理；细菌O-抗原需经100℃加热2h处理后应用。 1. 动物抗血清(多克隆抗体)的制备 制备动物抗血清涉及到免疫使用的抗原、实验动物、佐剂以及免疫方法等诸多因素；免疫所用抗原剂量与抗原种类、动物、免疫周期及所要求的抗体特性等有关。抗原剂量过低不能形成足够强度的免疫刺激；抗原剂量过高又有可能造成免疫耐受。 供免疫用的实验动物常有家兔、羊，马匹常用于制备大量抗毒素血清，豚鼠较适于制备抗胰岛素抗体和供补体结合试验用抗体。 根据抗原不同及实验要求，抗原注射信息系统可采用皮下、皮内肌肉、静脉、腹腔、淋巴结内等不同途径。初次免疫后需经过一段时间(3-4周)可进行再次或多次免疫，这样可以保持高水平抗体生成。在免疫加强最后一次注射后的一周内可以采集血清。抗血清提纯并检验合格后可经56℃30min灭活，再加入适当防腐剂，置低温(-20℃)保存(可达数月或数年)。 2. 单克隆抗体制备 1975年，Koehler和Milstein 成功应用杂交技术将小鼠的免 疫脾与小鼠的骨髓瘤细胞相融 合，由此产生的杂交瘤细胞传 承了两个亲代细胞的特点，既 保留了骨髓瘤细胞可以人工培 养且具无限增殖的特点，又具 有淋巴细胞(已致敏)合成分泌 特异性抗体的能力。 根据Burnet的抗体产生学说， 每株B-细胞系(从一个祖先B细 胞分裂繁殖而形成的细胞纯系 ---克隆系)只能产生一种针对 它所识别的特异性抗原决定簇 的抗体，如无变异，其基因也 是完全相同的。这种从一株克 隆B-细胞系产生的抗体就称为 单克隆抗体(McAb)。 免疫动物常选用BALB/C小 鼠(小鼠的一个品系，来自胚 胎预先感染了白血病病毒的小 鼠)，它具有的病毒DNA像一个 单一的孟德尔基因那样传递， 即异合子动物在每个二倍体细胞中具有一个拷贝的病毒DNA，而同合 子个体中有两个拷贝。在它们的组织中产生具有感染力的病毒，90%的小鼠在10月龄之前就可产生。由胸腺形成的淋巴瘤。单抗制备采用其B-细胞和骨髓瘤细胞。… 诱导细胞融合可采用生物学(仙台病毒)、物理学(电场、激光诱导)和化学(聚乙二醇、溶血卵磷脂)的方法；融合后再利用HAT培养基选择培养(H-次黄嘌呤，A-氨基喋呤，T-胸腺嘧啶)或代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞。［HAT培养中的氨基喋呤在化学结构上与叶酸非常相似，是叶酸还原酶的有效竞争抑制物，可阻断嘌呤碱的从头合成途径，使得骨髓瘤细胞不能在这种培养基中合成DNA而避免其过度生长繁殖。而杂交瘤细胞由于可从免疫脾细胞中获得次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶-HGRPT和胸苷激酶-TK，因而可通过另一途径(或称之为补救途径)利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成核苷酸，而在HAT培养基中存活，且大量繁殖。］ 用多孔培养板培养二周左右，在有杂交瘤生长的孔内取上清液检测有无特异性抗体；对有抗体产生的孔内的杂交瘤进行进行有限稀释以克隆细胞。重复数次以保证抗体确由单克隆细胞所分泌。 第二节 抗原抗体反应原理 体外的抗原抗体反应被称为血清学反应；抗原抗体结合时可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而会出现各种反应现象 。 1.抗原抗体结合具有特异性. 一种抗原分子只能与由它刺激机体所产生的抗体结合而发生反应；抗原的特异性取决于其抗原决定簇的数目、性质和空间构型。抗体的特异性则取决于Ig的Fab段可变区与相应抗原决定簇的结合能力；但是这种结合不是以共价键方式，而是通过较弱的短距离引力方式，如范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。 2.抗