天然药物层析分离PPT.ppt

第六节　层析分离 层析分离法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 一、层析分离法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 二、层析分离法的分类 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体物质作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 1、按两相所处的状态分类： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层析 气-液层析 2、 按层析的分离机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 亲和层析：利用不同组分与配基之间所具有的专一而可逆的亲和力，使生物分子分离 层析聚焦：将两性物质的等电点特性与离子交换层析相结合，使组分分离。 3、按操作形式不同分类： 三、柱层析设备 四、层析操作 五、常用的层析法 2、洗脱方法 1）溶剂洗脱法：采用单一或混合的溶剂进行洗脱的方法，是目前应用最广的方法。 用洗脱液体积对各组分浓度作图得出洗脱曲线 2）置换洗脱法：用置换剂洗脱。 置换洗脱液中含有一种吸附力大于各组分的物质 3）前缘洗脱法：洗脱液为样液本身。 3、吸附剂与洗脱剂的选择 吸附剂吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 1）吸附剂的类型： 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭 　酶分离中常用的有：活性炭、硅藻土、羟基磷灰石等。 　　　这些吸附剂在低PH值、低离子强度下，对酶有较强的吸附作用，在提高PH值、增加离子强度的条件下，酶可被解吸而洗脱下来。 （二）分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 分配系数K＝固定相中溶质浓度/流动相中溶质浓度 K与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力等条件的影响，在层析条件确定后，K值是一个常数。 （三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 　　　利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团 对各离子的亲和力不同而将物质分离的层析分离方法 1.原理: 根据待分离物质带电性质不同而将物质分离 平衡常数（分配系数）K＝组分离子在离子交换剂上的浓度/组分离子在溶液中的浓度 K值大的后洗脱下来，K小的先洗脱下来.带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来 a. 强、弱离子交换剂的选择： 强酸强碱型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱酸弱碱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性 若 pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂 若 pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂 4）离子交换剂的处理 p100 1. 基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。 Kd的取值范围是0－1。 但如果凝胶对待分离组分有吸附作用时， Kd将大于1 2.凝胶的种类和性质 3）加样 体积不能过多，不超过床体积的10％，最多不大于30％。 4）洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。 洗速不可过快，保持恒速。 5）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。 用0.02%NaN3防腐。 　以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相应管的A280为纵坐标，绘制洗脱曲线。 根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve，然后以蛋白质分子量的对数值（logMr）为纵坐标、Ve为横坐标，作出分子量标准曲线。 样品完全按照标准曲线的条件操作，根据紫外检测获得的洗脱体积，从分子量标准曲线查出相应的分子量。 （五）亲和层析 Affinity Chromatography 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 功能层析（function chromatography） 生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography） 母体（载体） 配基：抗原、底物或辅酶或抑制剂、受体 六 高效（压）液相层析（HPLC：High Performance（pressure） Liquid