双水相萃取脂肪酶.docVIP

双水相萃取脂肪酶 摘要：本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术，探究了双水相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果。同时也介绍了一些蛋白质含量及酶活检测的基本方法。 前言 脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)[3]，国内对于双水相萃取方法的研究也早在20世纪60年代就已经开始了。 与传统的蛋白质分离提纯方法相比，双水相萃取方法具有很多优点：体系含水量高，可达80％以上；蛋白质在其中不易变性；界面张力远远低于水－有机溶剂两相体系的界面张力，一般为0.5～10-4mN*m-1，有助于强化相际间的质量传递；系统中的传质和平均速度快，能耗小，分相时间短，一般只要5～15min；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等[4]－[5]。双水相萃取的方法在蛋白质、酶、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化等领域中得到了广泛的应用。所以这种分离方法在蛋白质以及酶的分离提纯中有着很大的应用前景。 现在研究最多的双水相体系有高聚物/高聚物以及高聚物/无机盐体系，常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等，无机盐主要有磷酸盐、硫酸盐等。本实验所采用的就是PEG/硫酸盐体系，另外对于一种不是很常见的双水相体系表面活性剂双水相体系也做了一些探究。 实验原理： 双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分离的。当双水相体系中的两种物质浓度达到一定比例时，就会形成两个稳定的且互不相溶的两相，由于脂肪酶在这两相中的分配系数不同，就会自动的向分配系数高的一相中移动，而其它的杂质则分配到另一相，这样就达到了分离提纯的目的。由于两相都是水相，所以一般对于酶的活性及稳定性不会有太大的影响。 为了得到适合的两相配比，就要通过绘制相图来进行分析，相图的绘制就是通过调整两相比例，得到能够分相的临界点，从而得到相图。 蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对照标准曲线即可得到蛋白质含量。 酶活的检测方法则有滴定法和pNPP法，滴定法是以橄榄油乳化液为底物，通过检测脂肪酶水解橄榄油得到的脂肪酸来确定其活性。而pNPP法则是利用脂肪酶水解4-硝基苯基磷酸二钠盐对硝基酚十二烷基硫酸十六烷基三甲基溴化铵聚乙烯醇 650 190 220 260 260 H2O/μm 400 400 400 400 200 （NH4）2SO4/μm 140 160 140 160 140 H2O/μm 200 200 180 200 180 （NH4）2SO4/μm 140 140 130.5 100 120 H2O/μm 180 150 150 150 100 （NH4）2SO4/μm 40 110.5 100 100 65 H2O/μm 100 100 100 100 100 （NH4）2SO4/μm 80 80 95 90 95 H2O/μm 100 100 100 100 所得的相图如下： SDS/CTAB双水相相图： 该相图为三角形相图，引用自文献[12]。在实验中我们发现在室温下基本无法分相，而且很多都凝成了固体装物质，无法摇动，在45℃水浴下也只有3号有分相现象，即上图中的左边1区域，而右边的双水相区则没有看到，而且该体系分相所需的时间也比较长，所以在后面的实验中并没有使用该体系。 双水相萃取：（PEG/（NH4）2SO4体系） 配制的双水相体系如下表： 1 2 3 4 5 6 7 8 PEG 15% 15% 15% 20% 20% 20% 25% 25% (NH4)2SO4 15% 20% 25% 15% 20% 25% 15% 20% 分相后所的到的体系中，上下相比例如下：(其中1号未分相，可能是由于浓度太低) 2 3 4 5 6 7 8 上相/ml 6.2 6.6 5.6 4.4 4 2.8 3.2 下相/ml 2.8 2.6 3.2 4.6 5 5.8 5.6 蛋白质含量测定： 标准曲线制作： 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 0 0.0967 0.1647 0.243 0.3093 0.4143 0.4873