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现代生物技术概论复习提纲 第六章 蛋白质工程 1. 了解蛋白质分子之间的相互作用； 蛋白质的亚基可以被解离成游离亚基，在一定条件下又可以重新聚合；某些具有四级结构的蛋白质分子之间，亚基可以聚合，产生有活性的杂交分子；不少多肽和蛋白质分子，不论其是否由亚基组成，都能聚合成聚合物。 2. 蛋白质工程的基本任务； 以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新的蛋白质；对现有的蛋白质加以定向改造、设计和构建，最终生产出比自然界存在的蛋白质更优良、更符合人类需求的功能蛋白质。 3. 图6-6蛋白质工程研究策略，利用反向生物学手段； 蛋白质工程的主要研究手段：利用所谓的反向生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其生物活性的高低程度。 4. 改变先有蛋白质结构的基本步骤； ①分离纯化目标蛋白质。 ②分析目标蛋白质的一级结构；分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。 ③根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。 ④根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。 ⑤对目的基因进行人工定点突变。 ⑥改造后的基因在宿主细胞中表达。 ⑦分离纯化表达的蛋白质并分析其功能，评价是否达到设计目的。 5. 改变蛋白质结构的核心技术包括基因的人工定点突变和蛋白质的人为进化，具体内容； （1）基因人工定点突变技术： ①M13载体法：该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物，利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。 ②PCR扩增法：该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因。PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。 （2）蛋白质的人为进化 易错PCR和DNA shuffling （DNA改组） 单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段。无引物PCR，具有互补3末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮shuffling循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。 6. 举两个蛋白质工程的应用实例； （1）胰蛋白酶：223个氨基酸残基和以异亮氨酸为N端的单肽链。Arg117位自溶点的缺失突变，得到缺失突变体，其结果表明该突变体的稳定性明显提高。将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心His57的pKa值，在pH较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。 （2）金属硫蛋白：富含半胱氨酸的小分子蛋白，半胱氨酸巯基可以结合大量的金属元素；金属硫蛋白由α和β结构域组成。在烟草中转入串联的α结构域基因后，提高了重金属抗性。 7. 蛋白质组学研究的三个领域； 1 蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学研究。 2 针对有关基因或转录组数据库的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群，即组成性蛋白质组学研究。 3 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要的生理/病理体系或过程的局部蛋白质研究，即比较蛋白质组学研究 。 8. 蛋白质组分析的基本过程（并参考课件上放的文献的步骤） ①样品制备（溶解、解聚等） ②分离（双向凝胶电泳） ③图像分析 ④蛋白质成分的分析与鉴定 ⑤蛋白质组研究中的样品制备 第七章 生物技术与农业 1. 利用生物技术诱导植物雄性不育的方法 ①组织培养诱导植物雄性不育 中国水稻所利用巴斯马提水稻品种进行胚根组织培养，然后将愈伤组织进行辐射，从而选育出巴斯马提雄性不育系。 ②基因工程诱导植物雄性不育 花粉绒粘层表达barnase基因阻断花粉正常的发育而造成败育，形成不育系；花粉绒粘层表达bastar基因转化植株中为恢复系形成的二系配套的油菜、烟草。反义RNA技术创造了拟南芥、玉米、油菜等植物不育系。 ③原生质体融合创造不育系 萝卜与油菜的原生质体融合而产生的细胞杂种——萝卜质油菜，在一般环境条件下表现为“雄性不育”。 匈牙利国家自然科学院Menczel等以链霉素抗性基因作标记在烟草品种间进行原生质体融合，实现了烟草细胞质雄性不育基因的转移。 2. 生物技术育种的一个重要应用是抗逆育种，通过了解各种抗性育种的实例（了解一个例子），掌握生物技术抗性育种的方法。P159 在一定逆性环境选择压力下，采用组织培养、原生质体融合和体细胞杂交等生物技术手段，可以定向筛选具有抗逆性的个体，培育抗逆新品种