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应用微生物学实10-29
实验一、酸奶生产菌的分离纯化及应用
一、实验目的和内容
了解乳酸菌的生长特性,学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法。
内容包括:
1. 从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化;
2. 乳酸菌饮料制作;
3. 自制乳酸饮料质量的品尝。
二、原理
酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质,经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品,具备鲜奶的全部营养成分,含有人体必需的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、乳糖酶和活性乳酸菌等。在发酵过程中,鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固,成为有弹性的凝块,颜色乳白、气味清香、酸甜可口,别具一番风味。
乳酸菌具有把奶类中的乳糖转化成乳酸的功能,称为乳酸发酵。在形成乳酸的同时也产生其他一些酸类物质,从而导致了pH 值的下降,当达到乳类蛋白质的等电点时(如牛奶蛋白质的等电点约在pH4.5 左右),引起蛋白质的沉淀,使原来流动性较大的乳类,因凝固作用而变成类似果冻的胶状物,称之为“凝乳”。
不管是何种酸奶,其共同的特点都是含有乳酸菌。这些乳酸菌在人体的肠道内繁殖时会分泌对人体健康有益的物质,因此酸奶对人体有较多的好处:一是能将牛奶中的乳糖和蛋白质分解,使人体更易消化和吸收;二是酸奶有促进胃液分泌、提高食欲、加强消化的功效;三是乳酸菌能减少某些致癌物质的产生,因而有防癌作用;四是能抑制肠道内腐败菌的繁殖,并减弱腐败菌在肠道内产生的毒素;五是有降低胆固醇的作用,特别适宜高血脂的人饮用。
和普通牛奶相比,酸奶的最大特点是含有大量活着的微生物,是具有生命力“活”着的特殊食品。酸奶中的微生物根据它们功能分为2大类:
1.发酵用乳酸菌:是指那些起源于奶制品长期用于酸奶制造的乳酸菌。
2.生物活性用乳酸菌:是近年从人体分离、驯化而成具有特定生物活性的乳酸菌,基本都是后述的益生菌。
发酵用乳酸菌主要用途是决定酸奶风味及口感,关系到酸奶本身的商品价值。生物活性用乳酸菌是用于强化酸奶营养价值,使它具有某些传统酸奶所不具备的生理功能,满足人们健康上的特殊需要。由于现存的生物活性用乳酸菌(益生菌)的大多数因是来自人体,在牛奶里生长发育缓慢,代谢产物除了乳酸以外还有其他多种挥发性物质,风味上差强人意。因此多数情况下,都是同时混合利用这2类乳酸菌。
在实验室中可以用“稀释涂布平板法”“平板划线法”来分离细菌。通常培养后通过观察细菌的菌落可以辨别是哪种细菌,也可以在培养基中加入特定的染色试剂使特定的细菌染色来观察。
三、实验材料和用具
嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus),保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus),乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。
BCG牛乳培养基,乳酸菌培养基,脱脂乳试管,脱脂乳粉或全脂乳粉,鲜牛奶,蔗糖,碳酸钙。
恒温水溶锅,酸度计,高压蒸汽灭菌锅,超净工作台,培养箱,酸乳瓶(200~280mL,),培养皿,试管,300mL三角瓶。
BCG牛乳培养基:
(A)溶液:脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚绿(B. C. G)乙醇溶液1mL,80℃灭菌20min。
(B)溶液:酵母膏10g,水500mL,琼脂20g,pH 6.8,121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。
乳酸菌培养基(CMRS):
蛋白胨 5g; 牛肉膏 5 g ; 酵母浸膏 2.5 g ; 乳糖 7.5 g; 土温80 0.5ml; 磷酸氢二钾 1g ; 乙酸钠2.5g ; 柠檬酸二铵1g ; 七水硫酸镁0.1g ; 四水硫酸锰0.1g ; 番茄汁 50ml; 琼脂条9g;
加入500ml蒸馏水中加热溶解,调pH值为 6.8,115℃,灭菌15分钟。
脱脂乳试管:
直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min 。
三、操作步聚
(一)乳酸菌的分离纯化
1.分离
取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5,,取其中的10-4,10-52个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL,分别接入BCG 牛乳培养基琼脂平板上,用无菌涂布器依次涂布,或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离,置40℃培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2.鉴别
选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中,40℃培养8~24h,若牛乳出现凝固、无气泡、呈酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入),革兰氏染色呈阳性,则可将其连续传代4~6次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用。
(二)乳酸菌菌种制备
选取凝乳作用较好的乳酸菌典型菌落,分别转至脱脂乳试管
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