7 外源基因的克隆与表达.ppt

1972 Paul Berg Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules. They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA, （一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。 （二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。幻灯片 30 3 工程菌表达及条件的优化 诱导时间 30’ 1h 2h 3h 4h 5h 6h 诱导条件的优化 化学诱导 IPTG 温控诱导 42 pH、补料、化学物质（SDS）等。 * * 生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology 主要内容 Contents： 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern and Western Blot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein 7 外源基因的克隆与表达 Heterogenous Gene Cloning and Expression 基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944） 2.DNA结构双螺旋模型 Watson Crick, 1953 3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg Crick ） 4.发现反转录酶 Baltimore Temin, 1970 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究 Lederberg, 1950-1970 6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，Smith和Nathans） 7. DNA体外重组（ Cohen等，1973） Paul Berg Herb Boyer 1973年是基因工程的元年。 这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家的心血与努力，他们在理论与技术上的卓越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的基础。 一、基因克隆的策略与技术路线 克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。 在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前基因克隆的主要策略。 1.基因克隆的策略 克隆外源DNA基本流程图示 2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 （1）分离制备待克隆的DNA片段； （2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接； （3）重组DNA分子转入宿主细胞； （4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子； 2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 （1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然后