8 食品中维生素A含量的测定ppt.ppt

营养与食品卫生学教研室 【目的】 1．了解高效液相色谱法测定维生素A的原理。 2．熟悉高效液相色谱仪的使用。 3．掌握高效液相色谱法测定维生素A的基本操作技术。 【原理】 样品中的维生素A经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。 【仪器】 1．高效液相色谱仪 （附紫外分光检测器） 2．高速离心机 3．旋转蒸发器 4．振荡混匀器 5．恒温水浴箱 【试剂】 1.无水乙醚 2.无水乙醇 3.三氯甲烷 4.维生素A标准溶液（1mg视黄醇/ml） 5.内标物溶液（10μg苯并[e]芘 /ml） 【操作】 1．实验条件 分析柱：Diamonsil(钻石)C18柱，5μm，150×4.6mm 柱 温：35℃ 流动相：100%甲醇，于临用前超声波脱气20min或在线脱气 流 速：1.0ml/min 紫外检测器波长：300nm 进样量：10μl 在上述色谱条件下测定，维生素A保留时间约为3.3min。 2．标准曲线的制备 （1）维生素A标准液浓度标定 准确吸取维生素A标准液Sμl，分别用无水乙醇稀释至3.00ml，并按下表中给定波长分别在紫外分光光度计上测定各维生素溶液的吸光值。利用比吸光系数计算出该维生素标准液的浓度。 标准类别 加入标准储备液的量(μl) 比吸光系数Ecm1% 波长π(nm) 视黄醇 10.0 1835 325 标准液浓度计算： 某维生素标准液浓度(mg/ml) =A/E×l/100×3.00×103/S×1000 式中：A — 维生素标准液的平均紫外吸光值； E — 该维生素1%比吸光系数； S — 加入标准液的量((μ1) 3.00×103/S — 标准液稀释倍数。 2．标准曲线的制备 （1）维生素A标准液浓度标定 （2）标准曲线的绘制 准确吸取维生素A标准液20.0μl，用无水乙醇稀释至3.00ml。取稀释后维生素A标准液100、200、500、1000μl置于小塑料离心管中，每管加入内标10μg/ml苯并[e]芘溶液250μl，并用无水乙醇稀释至1.25ml，混合均匀。选择合适灵敏度，取上述不同浓度的标准液各10μl，依次注入高效液相色谱仪进行色谱分析。维生素标准曲线以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或建立直线回归方程。 2．标准曲线的制备 （1）皂化 称取1～10g样品，置于250ml皂化瓶中，加30ml无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加100g/L抗坏血酸溶液5ml，10mg/ml苯并[e]芘标准液0.4ml，混匀。再加10ml氢氧化钾溶液，混匀。于沸水浴上回流30min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。 3．样品测定 3. 样品测定 （2）提取 将皂化后的样品移入250ml分液漏斗中，用50ml蒸馏水分2～3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100ml乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层 （3）洗涤 用约50ml蒸馏水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验直至水层呈中性(一般需6次左右，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加) 3. 样品测定 （4）浓缩 在三角漏斗内垫少许脱脂棉，加入无水硫酸钠(约5g)将乙醚提取液经过无水硫酸钠滤入与旋转蒸发器配套的250～300ml球形蒸发瓶内，用约10ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2ml乙醚时，取下蒸发瓶，用氮气吹掉乙醚。立即加入2.00ml无水乙醇，充分混合，溶解提取物。 3. 样品测定 （5）定容 将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min(5000r/min)，上清液供色谱分析。如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。并记下体积比。 （6）色谱分析 取样品浓缩液10μl，注入高效液相色谱仪进行分析。以标准品色谱峰的保留时间定性，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，在标准曲线上查出其相应的维生素含量。或用回归方程求出其含量。 【计算】 式中： C — 由标准曲线上查到的某种维生素含量，μl/ml V — 样品浓缩定容体积，ml M — 样品质量，g （1）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。 （2）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。 （3）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。 （4