抗460氧化实验方法4602012.docVIP

附 录 抗衰老实验 实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法） 一 实验原理： 超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性 Tris-HCl缓冲液，pH8.2 溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为： 在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度 299nm波长 在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。抑制率可根据下式计算： 式中FO和FX分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率 二 实验仪器和试剂： 1 主要仪器紫外可见分光光度计，10mL试管。 主要试剂Tris-HCl 缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。 三 试剂配制： 1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。 2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。 4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。现配现用，4h内有效。 四 实验方法： 1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min； 2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚 由10 mmol/L HCl配制 0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min； 3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1ml试样溶剂代替样品，每个处理均做三个重复。 五 数据处理: 超氧阴离子自由基清除率 % 100% A1-A2 /A1， 其中A1为空白的平均吸光度，A2为试样的平均吸光度。