抗体HRP标记方法.docVIP

HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法?戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。二、简易过碘酸钠法?本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的?HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 1小时。 （7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定 （1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。 （2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 （3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材 （1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 （2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。 （3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 （5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 （6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 （8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 （9）HRP(RZ3.0)。 （10）Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。 （11）搅拌器，分光光度计，离心机。 （12）透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。 二、简易过碘酸钠法 本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的 HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 1. 原理 经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 2. 标记步骤 （1）称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 （2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。 （3）将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。 （4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA 5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。 （5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4 2小时。 （6）将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。 其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。 3. 结果判定 除标记物IgG