分子诊断技术质量管理要求.ppt

即刻法优缺点 优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控 缺点：繁琐 初始阶段的质控数据，前3个质控值的CV对随后的结果影响大。 临床基因扩增检验室内质量控制操作 前20个数据使用即刻法，可对第3－20个数据进行质控判断 第21个数据开始使用常规质控方法进行质控判断 失控处理 及时查找原因，采取纠正措施 填写失控原因分析报告 相关负责人决定报告是否可发放 失控原因分析—阳性质控样本常见的失控原因 核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。 仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。 试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。 失控原因分析—阴性质控样本的失控原因 扩增产物的“污染” 临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 “污染”. 避免基因扩增检验假阳性结果的措施 严格的实验室分区 使用带“滤芯”的吸头 设立“阴性”质控（与标本同时处理） 使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂 临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。 避免基因扩增检验假阴性结果的措施 避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本 定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准 注意事项 在试剂准备区配置反应混合液，先将dNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再分装； 配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡 分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解 优先选择含UNG的试剂盒 试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性 扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌 标本处理应在标本制备区生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作 为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心 注意事项 吸弃上清提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。 标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放； 将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。 扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。 扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理； 工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁 结果判断 在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。 基线值（阈值）设定：遵从厂商规定 实验结果有效性判断标准 标准曲线平滑均匀，相关系数、内参等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。 阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。 以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效。 实验灰区标本的处理 定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。 复星CT：38≤Ct值40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct40判断为阳性，否则判为阴性。 达安CT: ABI7000：27≤Ct值30为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值30判为阳性，否则判为阴性。 Roche LightCycler：37≤Ct40为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值40判为阳性，否则判为阴性 组织标本的处理与质量控制均应该由有经验的病理技术人员和医师负责。如需要用显微切割法刮取组织以保证有足量的肿瘤细胞，应由病理医师审阅，标注出肿瘤细胞所在区域 必要时，被检基因组核酸（DNA和/或RNA）浓度应符合制造商规定的要求 扩增条件相同的不同检测项目扩增时应使用各自的标准曲线 室间质评 目的:监测检测结果的准确性 凡出具临床检测报告的项目均应参加室间质评 室间质评样本应与临床标本同等对待，及时分析室间质评反馈结果； 对不合格项目，应查找原因，（人员操作误差、仪器状态、试剂、质控品质量、评价方式、分组问题等）采取纠正措施 PCREQA评价方式: 组均值±3SD、 组均值±0.5log10 溯源至国家标准品得出的检测值换算成