8真菌病毒幻灯片.pptVIP

第八章 真菌病毒 最初1950从栽培的蘑菇病害的病原物中发现的 现有资料表明，病毒和真菌之间的关系极为复杂，真菌病毒己成为遗传学和分子生物学中很有价值的试验体系之一。 应用 真菌病毒的dsRNA可在动物体内诱导干扰素来防治病毒病 利用病毒防治植物病原真菌病害 病毒与真菌次生代谢产物的关系 一、真菌病毒与病毒状颗粒 真菌感染病毒的主要依据： ①电镜下找到非正常寄主组分的颗粒具有特定的体积和形态，外观似病毒； ②少数作过超薄切片或较详细的理化性状等研究，包括颗粒的组分有蛋白质外壳和核酸核心及其分子量，沉降系数，核酸类型，血清学关系以及寄主范围等； ③双孢蘑菇和产黄青霉真菌中的病毒曾做过柯赫氏定律的全过程。 真菌感染病毒的主要依据： 真菌中的病毒曾经用过几种名称： 真菌病毒 mycovirus 真菌噬菌体 mycophages ， Ds RNA质粒 double-stranded RNA plasmids 病毒状颗粒 Virus-like particle，VLP 。 真菌病毒并不能全部满足现在病毒概念所要求的标准；许多研究者谨慎地将在电镜下观察到的真菌中具有病毒外观的颗粒（其理化性质未确定）称作病毒状颗粒；在经过分离提纯，具有典型的病毒形态及核蛋白质性质，但在未得出结论性的侵染证据前，也有作者全部采用VLPs一词。 二、真菌病毒的检验技术： 1、电镜检验 菌体提取液检查 直接负染法 免疫电镜法 超薄切片电镜观察 2、血清学检验 ds RNA抗血清筛选 免疫电泳 对流免疫电泳 放射免疫测定病毒滴度 ELISA 单克隆抗体 1、电镜检验 菌体提取液检查： 首先获得一定量的纯净菌丝体或孢子 1g~几十g，随病毒浓度而定 ； 然后提取病毒存在的分部，做电镜观察。该方法可靠但不简便，是发现真菌病毒的主要方法。 直接负染法： 不经提取而直接从真菌子实体或斜面挑取小块菌体放置载玻片上，加一滴 2％pH 6. 0磷钨酸，用刀片在液滴内匀浆，将覆有碳膜的载网接触液面，用滤纸吸走多余水分。干燥后电镜观察。该方法简便，适于大量分离物的检查。 1、电镜检验 免疫电镜法： 将菌体放在研钵内加干冰研磨，用等量 W/V 的0.05 mol/L磷酸缓冲液pH7.2 制成悬液，于10 000 r/min 离心10 min，上清液用免疫电镜观察。 该方法较简便，灵敏度高，可用于无症状而有病毒的真菌菌株的检查。 超薄切片电镜观察： 有的真菌病毒是在细胞学研究中发现的；将菌体或产孢组织制成超薄切片，用透射电镜观察。 此方法虽不常用，但可发现有些不易检查到的真菌病毒 2、血清学检验 dsRNA抗血清筛选： 用人工合成ds RNA（如多聚肌苷酸Poly l，多聚胞苷酸Poly C）加甲基化牛血清蛋白作抗原制备抗血清，与真菌核酸提取物作免疫扩散试验；这种抗血清能与ds RNA产生沉淀，用电镜观察可检查出其中病毒的存在。 该法适于筛选ds RNA真菌病毒。 单克隆抗体检测： 利用 ds RNA特异性单克隆抗体，采用双抗体夹芯ELISA法，检测栗疫病菌中的ds RNA。 该法不仅能从低毒力菌株的总核酸粗提液中检测到ds RNA，不受其它核酸的干扰，而且比电泳法简便迅速，在大量筛选含ds RNA的栗疫病菌低毒力菌株中具有很大的实用价值。 2、血清学检验 免疫电泳： 用于检查真菌病毒的纯度； 真菌病毒样品在 0.5％琼脂糖 Tris-巴比妥酸钠缓冲液薄膜上电泳 40 min 60V ，然后在电泳槽的一侧加抗血清保温 24 h。出现沉淀后，洗去多余蛋白质，电镜检查沉淀线内病毒颗粒。 对流免疫电泳： 用1％琼脂覆盖在载玻片上，再加l ml琼脂糖，2排方向相反的孔相距 0.5 cm，负极加入 l ul真菌病毒提纯样品，正极加入等量抗血清，两边连接胶和电泳槽 Tris-琥珀酸盐缓冲液，300V电泳3 min后出现特异性沉淀带，可用电镜确定。 该法过程快速，材料也省。 2、血清学检验 放射免疫测定病毒滴度： 在 50 ml三角瓶中的 20 ml培养液内加入3H尿嘧啶；24 h后收集菌丝体提取病毒（带3H标记，加等体积1：5抗血清，37℃保温3 h，离心取沉淀，用磷酸缓冲液沉淀2次，悬浮沉淀，用液闪计数器测定病毒滴定度 c.p.m 。 该法极其灵敏，可用于比较菌体内病毒含量。 酶联免疫吸附分析ELISA： 适用于无症状而有病毒的蘑菇、香菇、平菇等食用菌栽培菌株的检测 1 真菌病毒的核酸类型 dsRNA病毒： 真菌病毒中大部分都是小的、球形或六边形颗粒，直径28－48 nm，有单层衣壳 相当于高等动物或植物 ds RNA病毒的内层衣壳 ，沉降系数为 100~200 S。大多数真菌病毒属 ds RNA，如蘑菇、香菇、小麦全蚀病。虽然真菌病毒的提纯十分