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细胞培养 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台 laminar flow 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2钢瓶之CO2压力。 5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染 水盘的水用无菌水，每周更换 。 5.3. 无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网 300小时/预滤网，3000小时/HEPA 。 6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类： 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管：15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene PP 为不透明材质，polystyrene PS 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶 Pyrex or Duran glassware ：100ml，250ml，500ml，1000ml。 2. 清洗： 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌： 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride溶液 次氯酸，即漂白水 或是蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。 培养基 1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。 2. 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制 以1 升为例 ： 3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸 HCl 或强碱 NaOH ，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。 3.2. 材料： 纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要），粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器，无菌血清瓶，0.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli