双缩脲法测定血总蛋白的方法学评价.doc

双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价 摘要：目的 评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法 配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果 双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R2为0.9877。结论 双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。 关键词：双缩脲[1]。方法学评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。 双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 二价铜离子[2]。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定 1. 仪器与试剂 1.1 仪器 721型分光光度计；水浴箱。 1.2 试剂 牛血清白蛋白；硫酸铜结晶 CuSO4?5H2O ；酒石酸钾钠 NaKC4H4O6?4H2O ；氢氧化钠 NaOH ；碘化钾 KI ；蒸馏水。 2. 双缩脲的配制 2.1 称取6g NaOH溶于新鲜制备的25 ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶液。 称取0.75 g硫酸铜，2.25 g酒石酸钾钠，1.25 g碘化钾依次溶解于125 ml蒸馏水中．在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25 ml，用蒸馏水定容至250 ml。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中 或内壁涂以石蜡的瓶中 。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。 2.2 通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下 顺序1：硫酸铜→酒石酸钾钠→碘化钾→氢氧化钠 顺序2：硫酸铜→碘化钾→酒石酸钾钠→氢氧化钠 这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的 如图1左 ，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色是褐色的 如图1右 ，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同，过程中颜色变化也不同，但最后的结果是相同的。 图1 左为先加酒石酸钾钠 图2 左为先加酒石酸钾钠 3. 批内重复性试验 3.1 材料 待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱 3.2 方法 3.2.1 取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1添加试剂。 表1 试剂添加 加人物 ml 试剂空白管 测定管×20 蒸馏水 0.06 — 待测样品 — 0.06 双缩脲试剂 3 3 3.2.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 3.2.3 计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。 3.3 结果 3.3.1 结果记录 表2 20个测定管的吸光度值 试管号 吸光度 试管号 吸光度 试管号 吸光度 试管号 吸光度 1 0.121 6 0.12 11 0.14 16 0.14 2 0.131 7 0.123 12 0.14 17 0.144 3 0.14 8 0.128 13 0.139 18 0.139 4 0.129 9 0.12 14 0.146 19 0.142 5 0.139 10 0.125 15 0.139 20 0.139 3.3.2 批内重复性试验结果处理 计算公式标准差，变异系数 标准差s 0.0086，变异系数CV% 6.42 3.4 讨论评价 3.4.1 批内重复性试验测得数据的CV% 6.42，CV%值比较大，超过4.0，说明测定的精密度比较低。原因可能有以下几点： ①实验中使用的分光光度计比较老旧，一直性能不稳定，多位同学使用后都表示结果不太好。 ②使用的加样枪很多都老化了，不好用，导致封密性不强，实验误差大。 ③个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。 ④所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗留一些有色物质