4物理图的绘制研究.ppt

STS作图原理 合格的STS特点 序列已知 在染色体上独一无二 寻找STS办法 表达序列标签（expressed sequence tag ,EST)从cDNA克隆中找到小段顺序 SSLP 具有多态性并已在连锁分析中定位的SSLP具有特别的价值。 随机基因组测序 STS的物理定位 辐射杂种 克隆作图 辐射杂种 含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞 人体细胞射线照射，染色体随机断裂，剂量与片段大小成反比。将辐射后细胞与正常仓鼠细胞融合，片段将整合到鼠类细胞染色体中进行扩增。 利用胸苷激酶或次黄嘌呤磷酸转移酶的缺陷细胞，采用HAT培养基选择。获得TK和HPRT基因的可生长。 一般每个阳性杂种细胞保存DNA占人基因组15－30%，5－10Mb 仅含单个染色体的杂种群 含有单个染色体的啮齿类细胞与仓鼠细胞融合 利用短分散核因子（short interspersed nuclear element ,SINE)Alu为探针，挑选出含人基因组的杂种细胞。 Alu平均4KB就有一个 作图单位：厘镭（centriRay ,cR) DNA分子暴露在射线下两个分子标记之间发生1%断裂的频率。 克隆作图 来自于全基因组的克隆库 来自于单个染色体 人类基因组物理图 交变电场琼脂糖凝胶电泳 基于克隆的基因组作图 质料载体－－λ克隆载体及λ与质料结合的粘粒－－ 拟南芥，1.2×108，需要2500个40KB克隆，如果达到99.9%的覆盖率，需要25000个，人类基因则需要上百万个。 大分子DNA的克隆载体 YAC（yeast artificial chromosomes,酵母人工染色体） 其是根据真核染色体的结构设计的 着丝粒 端粒起点 自主复制 可载容易为230－1700KB之间 含有人工染色体的酵母方可在基本培养基中生长， 插入片段存在时，酶失活，克隆显示红色，否则为白色 YAC缺陷 插入部分的稳定性问题 同一细胞内不同YAC的重组交换，形成嵌合顺序 噬菌体P1载体 将天然噬菌体基因组中的一段缺失，容易相当于缺失区段的大小及颗粒所容纳的空间。 可达125kb 是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70～100kb 大小的基因组DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r ，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。 结合了 P1 载体和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持 （Ioannou et al. 1994） 。代表性 PAC 载体 pCYPAC1 遗传结构图 见图 3-30 。基于 PAC 的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb～150kb 之间。 细菌人工染色体 BAC（bacterial artificial chromosomes) 其源于大肠杆菌的F质料，容易可达300KB 特点： 单拷贝复制 相对分子质量大 稳定 制备方法简单，便于机械化操作 BAC载体物理图 P1人工染色体 PAC（P1－derived artificial chromosomes) 结合了P1载体与BAC载体的优点，可载片段达300KB P1人工染色体 F粘粒 具有F质料的复制起点及λ的COS位点，功能与粘粒类似，拷贝数低。 重叠群的组建 相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群，其组建采用染色体步移法。 从基因组文库中挑取一个指定的或者随机的克隆，然后寻找与之重叠的另一个 依次延伸。 指纹作图 在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法首推克隆指纹排序。 指纹系指确定DNA样品所具有的特定DNA片段组成，一个克隆的指纹表示了该克隆具有的限定的顺序特征。 限制性带型指纹 限制性酶处理 凝胶分离 DNA片段部分相同，说明具有重