2012第十八章高效液相色谱精读.ppt

第十八章 高效液相色谱（ HPLC） 在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15％，加上衍生化的化合物，也不过20％左右。 高沸点、难挥发、热不稳定、离子型化合物、高聚物乃至生物大分子，很难用气相色谱法分析。 在经典的液体柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的柱色谱技术称为高效液相色谱法。 特点：应用范围广，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化等。 第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 固定相 液液色谱、液固色谱 分离机制 基本类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱 其他：化学键合相色谱、离子抑制色谱、离子对色谱、亲合色谱、手性色谱、胶束色谱、电色谱等。 二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法 （BPC） 在HPLC中应用最广 固定相：极性键合相 -CN, -NH2, 或二羟基等键合在硅胶表面 应用：分离极性、中等极性的化合物 （二）反相键合相色谱法 固定相：非极性键合相 十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等键合在硅胶表面 流动相：水＋与水混溶的极性调整剂 甲醇－水、乙腈－水 溶质的非极性部分在与极性溶剂分子间的排斥力的作用下，和键合相的烃基发生疏溶剂缔合； 另一方面，溶质的极性部分受到极性流动相的作用，有解缔合作用。 2. 保留行为的主要影响因素 （1）溶质分子的结构 溶质的极性越弱，疏水性越强，则与固定相作用越强，k越大，tR也越大。 （2）流动相 流动相表面张力越高，k越大 流动相介电常数越大，k越大 水的表面张力最大，有机溶剂含量增加，k值变小 （3）固定相： 键合烷基碳链越长，疏水性越强，k越大 （三）反相离子对色谱法 在固定相上涂渍或流动相中加入与溶质分子电荷相反的离子对试剂，来分离离子型或可离子化的化合物的方法称为离子对色谱法 反相离子对色谱 固定相：C18或C8键合相 流动相：含有离子对试剂的有机溶剂－水溶液 应用 适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型混合物的分离，还可借助离子对的生成引入紫外吸收或发荧光的基团 1. 离子对模型 2. 影响容量因子的因素 （1）离子对试剂的种类和浓度 季铵盐，分析带负电荷的物质 烷基磺酸盐或硫酸盐，分析带正电荷的物质 试剂浓度：在浓度较低时，浓度升高，k增大 试剂的烷基碳链越长，k越大 （2）流动相的pH 对弱酸、弱碱的保留有很大的影响 三、其他高效液相色谱法 离子交换色谱用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器为通用检测器 分类 抑制型（双柱型）、非抑制型（单柱型） 应用 无机和有机阴、阳离子，氨基酸，糖类，DNA和RNA的水解产物 （二）手性色谱法 利用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性化合物的对映异构体的色谱法 分离原理 对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构“配合物”，因稳定性的不同而分离 第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相 采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相为化学键合固定相 非极性键合相 C18 ODS、C8、C1、苯基 弱极性键合相 醚基、二羟基 极性键合相 ?Si(CH2)3NH2、 ?Si(CH2)2CN （二）键合相的特点 1. 键合反应 多为硅氧烷型键合相，以氯硅烷与硅胶反应而得 二、化学键合相色谱法的流动相 选择流动相时应注意的几个问题 2. 混合溶剂的极性和强度 （三）流动相最优化方法简介 优化标准： 实现最难分离物质在理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离 调节溶剂极性可使样品组分的k值在适宜的范围 例 在一反相色谱柱上，当流动相为30％甲醇和70％水（体积比）时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为0.35min。如何调整溶剂配比使组分的容量因子为5？ 三、分离条件的选择 1. 涡流扩散：固定相颗粒3～10um 2. 纵向扩散：很小，可忽略 3. 传质阻力 （1）固定相传质阻力 化学键合相色谱中，键合相多为单分子层，可忽略 （2）流动相传质阻力 与固定相颗粒粒度的平方成正比，与组分分子在流动相中的扩散系数成反比 （二）正相键合相色谱法的分离条件 分离含双键的化合物，常用氰基键合相 分离多官能团化合物，常用氨基键合相 流动相：烷烃＋极性调节剂 （四）反相离子对色谱法的分离条件 （1）离子对试剂 分析酸、带负电荷的物质时，常用季铵盐 分析碱、带正电荷的物质时，常用烷基磺酸盐或硫酸盐 （2）流动相的pH 调节pH，试样组分和离子对试剂全部离子化 （3）有机溶剂及其浓度 有机溶剂的比例越高，极性越小，k越小 被测组分或离子对的疏水性越强，即极性越弱，需有机溶剂的比例越高 四、其它