无菌操作技术讲(一)(二).doc

无菌操作技术（一）—器皿的清洗、包扎、灭菌及培养基的配制 实验目的： 1、掌握实验用器皿的清洗、包扎方法 2、了解常用的灭菌方法—干热灭菌、湿热灭菌、紫外线灭菌及化学灭菌 3、掌握培养基的配制 一、实验用器皿的清洗及液的配制实验中所使用的玻璃仪器及塑料器皿清洁与否，直接影响实验结果，往往由于器皿的不清洁或被污染而导致较大的实验误差，甚至会出现相反的实验结果。因此，实验用器皿洗涤清洁工作是十分重要的基本操作，是做好实验的前提及实验成败的关键之一。 洗涤液的种类及配制 （1）0.5%去垢剂溶液（常用洗涤液）。 去垢剂是能使蛋白质变性的一类化学物。 去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。[生化]去垢剂（detergent） A．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。 B．阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用，常用于核酸的提取。 C．阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净（TMPB）、杜灭芬等，消毒灭菌类居多。 D．天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类（如环糊精）等。 E．两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。 （2）铬酸洗液[又称重铬酸钾（或钠）——浓硫酸洗涤液，简称洗液]广泛用于玻璃仪器的洗涤。其配制方法如下： 称取5g重铬酸钾(或钠)粉末放入250ml烧杯中，加5ml水，尽量使其溶解。然后边搅拌，边缓缓注入浓H2SO4l00ml，待洗液温度冷却至40以下，将其转移到具玻塞的细颈干燥的试剂瓶内贮存备用。称取10g重铬酸钾粉末置于500ml烧杯中，加水20ml，尽量使其溶解。然后慢慢注入浓H2SO4180ml，随加随搅拌。冷却后贮于具玻塞的细颈试剂瓶中备用。量取100ml工业硫酸置于250ml烧杯中，小心加热，慢慢加5g重铬酸钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解后，冷却并贮于具玻塞的试剂瓶中备用。（3）浓HCl（工业用）常用于洗去水垢或某些无机盐沉淀。（4）浓HNO3（常用于洗涤除去金属离子）。（5）1mol·L-1KOH溶液。（6）8mol·L-1尿素洗涤液（PH1.0）适用于洗涤盛蛋白质溶液及血样的器皿。（7）10-3mol·L-1EDTA溶液用于除去塑料容器内壁污染的金属离子。（8）5%—10%磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）溶液（用于洗涤油污物）。（9）氢氧化钾（KOH）的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠（NaOH）溶液，适用于清除容器内壁污垢，但这两种强碱性洗涤液对玻璃仪器的侵蚀性很强，故洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。（10）有机溶剂：丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脱油脂、脂溶性染料等污痕。二甲苯可洗脱油漆类污垢。2．玻璃仪器的清洗（1）初用玻璃仪器的洗涤新购置的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用去垢剂（0.5%水溶液）或肥皂水洗刷，再用自来水洗净。然后浸泡1%—2%HCl溶液中过液，次日取出用自来水充分冲洗，最后再用蒸馏水漂洗数次，置烘箱内烘干或倒置晾干备用。（2）使用过的玻璃仪器的洗涤 一般玻璃仪器洗涤许多污染物（包括有机物及金属离子等）易粘附于玻璃容器的内壁上，故每次使用均须及时清洗。通常情况下先用自来水冲洗?至无污物，再用去垢剂洗涤或浸泡于0.5%去垢剂水溶液中，将器皿内外（特别是内壁）仔细刷洗后，用自来水充分洗净，最后用蒸馏水漂洗数次，置烘箱（或微波炉）烘干或倒置在清洁处晾干备用。凡洗净的玻璃器皿，其壁上不沾有水珠，否则表示尚未洗净，应按上述方法重新洗涤。量具玻璃仪器不能烘烤，只能晾干或风干。对于进行高灵敏度的分析及检测实验所用的器皿，除用上述方法清洗外，还需采用其他特殊洗涤方法彻底清除污染物，使器皿洗得十分洁净是非常必要的。一般是把玻璃器皿浸泡于铬酸洗液中4—6h或过夜，再分别用自来水充分冲洗和蒸