蛋白纯化案例教学.docVIP

案例教学 问题：（我们在试验中遇到了一个蛋白纯化的难题，我先要纯化一个蛋白，融合了一个his标签，但是纯度并不是很好，我们采用了离子交换进一步对目标蛋白进行，但是挂柱效果不佳，不知道姜老师有什么建议帮我们解决这个问题。 SWIK-LAP 基本的一些性质：融合His标签 Mw:～66kD PI:～4.81 第一次SWIK-LAP纯化：（磷酸缓冲液） Ni柱初步纯化（1ml预装柱） Buffer: 平衡Buffer : 50mM PB, pH 8.0 200mM NaCl 0.1% Tween-20 洗脱Buffer: 50mM PB, pH 8.0， 200mM NaCl 0.1%Tween-20，50/100/200/300mM咪唑梯度 结果：50mM咪唑即把大部分目的蛋白洗脱下来了，纯化效果不好。 G25换盐 buffer： 50mM PB， pH 8.0 DEAE FF阴离子柱进一步纯化（1ml预装柱） 平衡buffer： 50mM PB， pH 8.0 洗脱buffer： 50mM PB，pH 8.0 ，200mM/400mM/600mM/800mM NaCl梯度洗脱 结果：大部分蛋白都没挂上柱直接穿过了。 用0.4M NaCl和0.6M NaCl洗脱有蛋白峰。  第二次SWIK-LAP纯化：（Tris缓冲液） Ni柱初步纯化（1ml预装柱） Buffer: 平衡Buffer : 20mM Tris, pH 8.0 500mM NaCl 洗脱Buffer: 20mM Tris, pH 8.0， 500mM NaCl，50/100/200/300mM咪唑梯度 结果：相比于PB缓冲液，Tris缓冲液过ni柱穿过的目的蛋白较少。 200mM咪唑能洗脱下大部分目的蛋白，但杂蛋白仍然很多。 Note：50-1意思是50mM咪唑收集第一管样品，-2，-3是第二和第三管，其他的表示类似 G25换盐 buffer： 50mM Tris， pH 8.0 100mM NaCl DEAE FF阴离子柱进一步纯化（1ml预装柱） Buffer： 平衡buffer： 50mM Tris， pH 8.0 100mM NaCl 洗脱buffer： 50mM Tris，pH 8.0 ， 200mM/400mM/600mM/800mM NaCl 梯度洗脱 结果：目的蛋白主要在400mM盐浓度洗脱下来。但杂带并没有去除。 姜老师回复： 你好，高兴收到你们的反馈。 你的附件中的结果我看到了，很不错，你的表达很成功：表达水平挺好，溶解性也很不错, 可以肯定能纯化出来。针对你来信提出的问题，现在有几个要点跟你讨论： 首先是你的样品制备，尽管你没有标出分子量，但从电泳看你这个融合蛋白分子量较大，按照我课上讲过的，意味着将来可以使用分子筛来进一步帮助纯化会有很好的选择性，但我注意到了你融合蛋白条带向下有smear，很像是有蛋白降解发生，希望你按照我讲过的样品制备专题中，防止蛋白质降解的内容进行鉴定和完善。 第二是IMAC的洗脱，你有层析仪，那就最好使用梯度洗脱，咪唑梯度和pH梯度都是可以的，当然你要是使用Tris.HCl梯度的话，那就更精彩，因为下面接阴离子交换更方便，我都讲过了的。这一步先尽量减少杂蛋白的含量； 第三是离子交换，你应当回忆下我讲的内容，50mM的磷酸盐对于DEAE FF肯定是离子强度太高了，挂不上是正常的啊，我讲义上有离子交换的buffer表啊，你换用50mM的Tris.HCl，pH8.1-8.3就可以了，要是再挂不上，就换阳离子交换或高盐下的分子筛。