第十三章分子生物学常用技术及其应用.docVIP

第二十一章 常用分子生物学技术的原理及其应用 基因工程 一、基因工程的基本概念 将目的基因与载体DNA连接起来再导入宿主细胞，并对目的DNA片段作选择性扩增和表达。其中将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。 二、工具酶 限制性核酸内切酶 1.限制性核酸内切酶的概念 2.限制性核酸内切酶的命名 3.限制性核酸内切酶的识别和切割位点 （二）其它工具酶 1.DNA连接酶 2.DNA聚合酶 3.逆转录酶 4.多核苷酸激酶 5.碱性磷酸酶 6.末端脱氧核苷酸转移酶 三、载体 （一）质粒 （二）噬菌体 （三）粘粒 （四）病毒 四、重组DNA技术的基本原理 基因工程中最主要的工作是进行分子克隆，即制备DNA片段，通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。 （一）重组DNA技术的基本过程 1、目的基因的制备 1)基因组DNA文库 2)制备cDNA文库 3)聚合酶链反应 化学合成 2．目的基因与载体的连接 1）粘性末端连接 2）同聚物加尾连接 3）平行末端连接 4）人工接头连接 3．将外源DNA导入宿主细胞 1）.转化：指将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 2）.感染：是以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。 4．目的基因的筛选和鉴定 1）.遗传学方法：针对载体携带有某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。 2）.分子杂交方法：利用32P标记的探针与转移至膜上的重组DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。 3）.免疫学方法：利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。 5．克隆基因的表达 产生mRNA和合成目的基因的蛋白质产物。 五、基因工程在医学中的应用 医学基础研究 建立人类染色体的基因文库，为进一步寻找基因、分析基因序列奠定基础。 疾病诊断和治疗 基因工程药物 ①利用基因工程技术改造传统的制药工业 ②利用克隆表达的基因生产药用肽类和蛋白质 转基因动植物 转基因动物在医学上可用作特定的实验模型，还可以用于生产药用蛋白质。甚至可用于器官移植。 人类基因组计划 人类基因组计划的目标就是分析人类基因组DNA的全部核苷酸序列，识别所有基因的编码序列，确定基因的位置及其功能，与人类遗传病相关的致病基因的定位、克隆、功能研究和测序等发现新基因、探明疾病发病机制、预见发病风险和诊断疾病。 蛋白质工程 按照人们的设想和构思，通过基因改造来改变蛋白质的结构。 第二节 核酸分子杂交技术 一、核酸分子杂交的基本原理 二、核酸分子杂交的基本方法 （一）Southern印迹杂交 （二）Northern印迹杂交 （三）斑点及狭缝杂交 （四）原位杂交 三、探针的标记 （一）探针的特征 （二）探针的种类和制备 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.寡核苷酸探针 4.RNA探针 （三）探针的标记物 1.放射性核素标记物 2.非放射性核素标记物 （四）标记方法 第三节 聚合酶链反应 一、PCR的基本原理 加热变性 退火 延伸 二、PCR的基本反应 以DNA为模板的反应 以mRNA为模板的反应——RT-PCR PCR产物的积累规律 三、PCR的应用 RT-PCR 用于分析基因转录产物，构建cDNA文库 用于mRNA的检测、调控元件的分析 用于基因组制图与测序 利用PCRC技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。 用于病原微生物的检测 遗传性疾病的诊断 在制药工业中的作用 第四节 DNA芯片技术 DNA芯片技术的概念 DNA芯片技术的主要类型 原位合成芯片 DNA微集阵列 DNA芯片技术的基本原理与方法 （一）芯片的制备 1.支持物的预处理 2.原位合成芯片的制备 （1）光介导原位合成法 （2）压电打印合成法 3.DNA微阵列的制备 （1）探针的制备 （2）打印 喷墨打印、针式打印 （3）探针的固化 （二）样品的制备 样品的分离纯化、扩增和标记等 分子杂交 检测分析 四、DNA芯片技术的应用 1.DNA序列测定 2.突变及多肽性分析 3.基因表达分析 4.基因组研究 5.药物研究与开发 6.基因诊断 第五节 基因诊断和基因治疗 基因诊断：是以DNA