磺化聚二氟乙烯(pvdf)在质粒dna酶切体系.docVIP

一种新的吸附介质：磺化聚二氟乙烯(PVDF)在质粒DNA酶切体系纯化中的应用* 生命科学学院 99级生物科学专业 杨竞 摘要 作者提出一种新的质粒DNA酶切体系纯化策略，即利用氯磺酸磺化后的聚二氟乙烯（PVDF）样品吸附除去酶切体系中的DNA限制性内切酶，而达到纯化目标质粒DNA的目的。通过对比实验证明，所得磺化样品与未磺化样品相比，在通常酶切体系环境中，对质粒DNA的吸附比例很小，而对限制性内切酶则有着很高的吸附能力。测定了磺化样品的磺化反应程度、磺化样品对质粒DNA和限制性内切酶的吸附比例曲线，以及对限制性内切酶的吸附反应动力学曲线，找出了对于通常酶切体系最适的吸附剂用量。另外通过实验还证明，经过磺化聚二氟乙烯样品处理后的体系对限制性内切酶酶活没有影响，以及磺化样品对限制性内切酶的吸附不存在特异性，从而使得此种纯化策略及所得新型纯化吸附剂在科研和生产中获得广阔的应用前途。 关键词：磺化反应，聚二氟乙烯（PVDF），固相吸附，质粒DNA酶切体系纯化 前言 一．研究背景： 当今分子生物学研究中所利用的最常见的克隆手段之一便是质粒DNA酶切体系，随着该体系在应用范围上的不断扩展，该体系的纯化及目标质粒DNA回收的各种方法也在不断的发展。但是，目前最普遍使用的纯化策略都是将反应液相中的目标质粒DNA吸附于某种固体介质，如玻璃粉、聚合树脂、聚合物膜等，而达到与液相中其他成分分离并纯化的目的。虽然此种回收策略已经过一二十年的改进和发展，然而其中依然存在一些明显的缺点。 首先，最大的不足也是最大的困难就是，由于此种纯化策略涉及质粒DNA的固相吸附和再洗脱的两次平衡过程。每步平衡都有不可避免的损失，因此通过此种策略回收的质粒DNA最小损失率一般都大于30%，这对于质粒DNA的微量反应操作显然是无法令人满意的。 其次，操作过程繁琐，体系的一次纯化往往包括凝胶电泳及目标条带的回收两大步骤，具体又包括质粒DNA固相吸附和再洗脱的过程。繁琐的操作一方面使得损失率难以降低，另一方面还增加了质粒DNA受损的可能性，这也是亟须改进之处。 另外，目前常见的DNA纯化体系往往存在一定程度的污染，如使用特定的有机溶液如硫氰酸胍等，这些从长远角度而言，对操作人员的人身健康是不利的。 总之，可以看出，虽然经过多年的发展，目前的DNA纯化体系仍有不完善之处，其中有些不足乃是原理层次上的。这就提醒我们，需要一种新的思路来考虑质粒DNA酶切体系纯化方法的设计，也许这才是真正的解决问题之道。 二．研究目的和意义： 正是为了解决目前所面临的困难，在此作者提出一种新的质粒DNA酶切体系的纯化思路，即将质粒DNA尽量保留在原有液相体系中，而设计出另一类固相吸附剂，将体系中的其他杂质――主要是限制性内切酶通过吸附除去，将纯化策略从相反的方向来进行。而为了实现这一思路设想，需要考虑以下几点： 1．在通常酶切体系下，限制性内切酶带有正电，为了达到尽量吸附其的目的，所设计的固相吸附剂应带有负电基团或能与蛋白质特异结合的化学基团。 2．在通常酶切体系下，质粒DNA带有负电，为了达到尽量保留其的目的，所设计的吸附剂同样应带有负电基团，以达到排斥质粒DNA与吸附剂结合的目的。 3．所设计的固相吸附剂应有足够大的吸附能力，以达到使用尽可能少的吸附剂便可以除尽体系中的限制性内切酶的目的。 磺化聚二氟乙烯正是满足了以上条件。首先，聚二氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride)膜常用于实验室中的蛋白质操作，而在此之前对其的研究也一直集中于其在蛋白质测序或分析中的应用。它作为一种性能稳定的聚合物，可以抵抗强酸、有机溶剂和还原剂的腐蚀，并与蛋白质依靠氢键或静电亲和力可逆结合，常用于微量蛋白质的测序操作，是一种常见且理想的蛋白质固相吸附剂。 其次，通过将聚二氟乙烯粉末样品磺化，一方面可以利用磺化样品中的–SO3H 基团在碱性环境中电离形成的–SO3－ 强负电基团与带正电的蛋白质结合，从而提高对其限制性内切酶的吸附力。另一方面，由于–SO3－所带有的负电性，可以有效排斥质粒DNA与吸附剂的结合，降低吸附剂对质粒DNA吸附造成的损失。 本实验正是基于以上的思路，首先设计出一套简便的聚二氟乙烯样品磺化途径，并在与未磺化样品及某一商品化的DNA纯化试剂盒的对照基础上，肯定了此种纯化策略的可行性和优越性。随后测定了所得样品的磺化程度、对质粒DNA的单位吸附量和对限制性内切酶的单位吸附量，以及吸附反应动力学曲线，找出对于常见的质粒DNA酶切体系纯化所需的最适磺化聚二氟乙烯样品用量，使所得结果获得充分的实用价值和广阔的应用前景。首先它可以替代现有的一些质粒DNA酶切纯化体系，由于纯化策略的改变而有效的降低目标质粒DNA的损失率。其次，它可能用于PCR体系的纯