复方丹参滴丸对D—半乳糖致衰大鼠小脑的作用 .doc

哈尔滨医科大学学报. 2002,36 2 :115-117 复方丹参滴丸对D—半乳糖致衰大鼠小脑的作用 扬志文1，王孝铭2 哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室；2.病理生理学教研室，黑龙江 哈尔滨150086 [摘要]目的 研究超氧化物歧化酶 SOD 及细胞凋亡在D-半乳糖致衰大鼠小脑皮质的增龄变化及复方丹参滴丸的抗氧化作用。方法 将Wistar大鼠分为正常对照组、衰老模型组及复方丹参组，采用组织匀浆法测定各组大鼠小肠组织中的SOD活性；采用石蜡切片甲基绿-哌洛宁染色法计数各组大鼠小脑皮质蒲肯野细胞的凋亡指数．并将结果进行比较。结果 与正常对照组比较，衰老组大鼠小脑SOD活性降低 P 0.01 ，蒲肯野细胞的凋亡指数增加 P 0.01 ；而复方丹参组与衰老组的比较结果显示小脑SOD活性增加 P 0.05 ，蒲肯野细胞凋亡指数降低 P 0.01 。结论 SOD及细胞凋亡在衰老过程中起着重要作用，复方丹参滴丸能提高SOD活性，降低凋亡指数，所以具有一定的抗氧化作用。 关键词：小脑皮质；超氧化物歧化酶；凋亡；衰老；大鼠 中图分类号：R972.2 文献标识码：A 文章编号：1000—1905 2002 02-0115-03 近年来，有关衰老机制的研究方兴未艾，在众多的研究中，自由基学说和细胞凋亡学说越来越受到重视。许多研究资料表明[1-3]，随年龄增长，机体内自由基的不断累积与细胞凋亡率的明显上升有密切关系，超氧化物歧化酶 SOD 是体内一种重要的能够特异性清除自由基的抗氧化酶。本文利用D—半乳糖致衰老模型研究了大鼠小脑随增龄SOD及蒲肯野细胞凋亡的变化，并初步探讨了复方丹参滴丸在抗氧化方面的作用。 材料与方法 1.1 实验动物与药品 纯系健康6月龄Wistar大鼠48只，雌雄各半，其中雄性体重400g±10g，雌性300 g±10g，由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供。自然条件下饲养，饮水、接食任意。所用药品为D-半乳糖：上海试剂二厂，批号921212；复方丹参滴丸：天津天士力制药集团有限公司，批号座机电话号码。 1.2 方法及结果判定 1.2.1 分组：将Wistar大鼠随机分成3组，每组雌雄各半：①衰老模型组：每天腹腔注射D-半乳糖50mg/Kg；②复方丹参组：每天腹腔注射D—半乳糖50mg/kg的同时，腹腔注射复方丹参滴丸5粒/千克；③空白对照组：每天腹腔注射等量0.85%生理盐水。各组大鼠在连续注射8周后处死，做如下指标测定。 1.2.2 总-SOD测定：3组大鼠每组随机各取8只，雌雄各半。用1%戊巴比妥钠40gm/kg腹腔注射麻醉后，取出小脑，立即加入组织块重量9倍的冷0.85%理盐水，制成10%小脑组织匀浆，然后3000—4000r／min离心15min取适量上清液测SOD活力。测试试剂采用南京建成生物工程研究所提供的SOD试剂盒，蛋白质测定采用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒。按公式计算出各组大鼠小脑SOD活力，所有数据以均数±标准差 ±s 表示，统计结果用方差分析。 1.2.3 甲基绿-哌洛宁染色：①取材与制片：3组大鼠每组随机各取8只，雌雄各半。1%戊巴比妥钠 40mg/Kg 腹腔注射麻醉下，按图谱取小脑蚓部 Ⅷ、Ⅸ区 组织，组织块厚度为1.5-2mm，立即置于Camoy固定液中，4℃固定4h，然后直接转入95%乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚4μm。②甲基绿纯化：新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理，以去除甲基紫。方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾人洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充分混匀，使其内的甲基紫溶于氯仿中而呈现紫红色。旋动分波漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10m1，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，4℃保存。③波配制 临用前配制，滤纸过滤 ：2%甲基绿贮存液5m1，5%哌洛宁水溶液1ml，蒸馏水12m1，0.2mol/L醋酸缓冲液 PH4.8 18m1。④染色步骤：切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水，置染液中室温下染片15min，取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液，95%乙醇迅速分化，100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂片[3、4]。 1.2.4结果判定：光学显微镜下调亡细胞的体积变小，细胞核固缩，甲基绿使细胞核DNA特异性着色呈绿或绿蓝色；细胞凋亡时常伴有蛋白质合成增加，呢洛宁使胞浆RNA特异性着色呈紫红色。观察时计算凋亡指数，即随机选择约10～20个视野，计数凋亡细胞的百分率。所有数据以均数l标准差所有数据以均数±标准差 ±s 表示，统计结果用方差分析。 2 结果 由于甲基绿和哌洛宁的特殊染色性质，可见正常的蒲肯野细胞排列整齐、大小均一，细胞质染成淡粉红色，核呈淡绿色，核仁清晰；随着年龄的增加，