实验九血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）.doc

实验十四 血清胆固醇测定 （胆固醇氧化酶法） 胆固醇的测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类。化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定，后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量。酶法由于操作简便准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分的干扰，目前已成为测定胆固醇的主要方法。4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD）催化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，在500nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下： 【器材】 试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计。 【试剂】 酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒。 1. 酶应用液 胆固醇酶试剂的组成为： pH6.7磷酸盐缓冲液 50mmol/L 胆固醇酯酶 ≥200U/L 胆固醇氧化酶 ≥100U/L 过氧化物酶 ≥3 000U/L 4-氨基安替比林 0.3 mmol/L 苯酚 5 mmol/L 此外还含有胆酸钠和Triton X-100，胆酸钠是胆固醇酯酶的激活剂，表面活性剂Triton X-100能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯的水解。 2． 5.17 mmol/L（200mg /dl）胆固醇标准液 精确称取胆固醇 200mg溶于无水乙醇，移入100ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度 也可用异丙醇等配制 。 【操作】 取试管3支，编号，按下操作。 表3-15 酶法测定血清胆固醇操作步骤 加入物（ml） 测定管 标准管 空白管 血清 0.02 － － 胆固醇标准液 － 0.02 － 蒸馏水 － － 0.02 酶应用液 2.00 2.00 2.00 混匀后，37℃水浴保温15分钟，在500nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。 【计算】 【注意事项1. 黄疸血清过高的胆红素可还原—部分反应中的H2O2，降低显色反应，使结果偏低。但测定胆固醇，胆红素对酶法的干扰比化学法小。2. 用胆固醇标准液引起的误差大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准。3. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加COD的空白管从结果中减去后纠正。4. 其它影响因素，如维生素C、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差。～