文心兰EIN2基因的选殖与分析.doc

文心蘭EIN2基因的選與分析Molecular Cloning and Characterization of EIN2 Gene in Oncidium Gower Ramsey 研究生：徐榮杰Rong-Jie Shiu 指導教授：陳幼光Yu-Kuang Chen、鄭萬興博士Wan-Hsing Cheng 【摘要文心蘭 Oncidium 為台灣重要經濟花卉之一，目前佔日本文心蘭進口切花總量達70%以上。由於文心蘭在採收、包裝時常易造成花朵花藥蓋 pollinia cap 脫落，導致文心蘭切花瓶插壽命縮短。在蘭科植物授粉作用 pollination 或去雄 emasculation 所造成的萎凋現象一般認為主要是乙烯 ethylene 的作用，因此推測花藥蓋脫落造成文心蘭提早老化與乙烯的產生有密切關係。已知EIN2基因在乙烯訊息傳遞過程中扮演中心角色，為正向調控因子，為了解決文心蘭因乙烯所造成的老化現象，所以我們選殖文心蘭EIN2基因，並探討其組織基因表現量的差異與功能。將目前已發表不同物種之EIN2基因，包括阿拉伯芥 At5g03280 、矮牽牛 AY353249 、玉米 AY359584 及水稻 AY396586 ，經軟體比對分析，在序列保守區域設計兩組退化性引子 degenerate primer 。經兩組退化性引子增幅 nested PCR 及RACE延伸，結果可得文心蘭EIN2基因全長4,815 bp，可轉譯1,287氨基酸。經序列比對分析，可觀察到EIN2蛋白質所具有的十二個跨膜區域亦存在文心蘭的EIN2中。與其他物種相比後顯示，文心蘭EIN2蛋白與同為單子葉作物的水稻及玉米具有較高的相似度，分別為61%和60%。南方墨點分析顯示EIN2至少有四個拷貝分佈於基因体組內。文心蘭EIN2基因在植株各個部位皆有表現，以小花苞與盛開花的表現量最多。文心蘭EIN2基因會受外源性乙烯所調控，在外加乙烯13.2 ppm濃度下，一小時及四小時處理後的表現量皆下降，但在處理乙烯後的24小時，其表現量有回升的趨勢，但總量還是低於未處理的表現量，所以推測乙烯對EIN2基因有回饋抑制作用。文心蘭EIN2啟動子的分析結果顯示，文心蘭EIN2基因可能受其他荷爾蒙如離層酸 Abscisic Acid, ABA 、生長素 Auxin 、茉莉酸甲酯 MeJA 、水楊酸 Salicylic Acid, SA 、吉貝素 Gibberellin 以及環境逆境，如冷、熱與創傷 wounding 等因子所共同調控。關鍵詞：文心蘭 Oncidium 、花藥蓋 pollinia cap 、EIN2 ETHYLENE-INSENSITIVE 2 、乙烯 ethylene bstract】 Oncidium is one of the most important economic crops in Taiwan, which occupies over 70% of the Japanese Oncidium cut flower imported market. However, the vase life of its flowers is often shortened due to pollinia cap dislodgment during harvesting and packaging. In orchid, wilted flowers after pollination or emasculation are generally attributed to the effect of ethylene; thus, the early senescence of Oncidium flowers caused by pollinia cap dislodgment is closely correlated to ethylene production and action. To solve this problem, we attempted to block ethylene action in Oncidium to delay flower senescence. As the EIN2 gene, a positive regulator, plays a central role in ethylene signal transduction, we cloned this gene and characterized its expression pattern and function. Degenerate primers for amplifying OnEIN2 were designed by alignin