有效降解餐余油脂菌株的分离及培养.doc

有效降解餐余油脂菌株的分离及培养 吴伊文 引言 随着上海的日益发展，人民的生活质量越来越高，享受消费的比重明显增大。上海的餐饮业也随之得到了快速的发展。与此同时，合理处置餐饮泔脚垃圾也成为新的课题。据上海市农委等部门的检测，泔脚携带着大量细菌和病菌，潜伏期1～20年不等。过去一直把它作为猪饲料，这样可能导致这些病菌进入人体，严重危害人体健康。而泔脚又经常被随意露天放置，极易腐烂变质，严重影响市容环境。 现在市场上处理这类问题的费用在不断提高。使用化学溶剂又存在许多副作用。本次课题目的是研究不同于一般，而是希望找到一类微生物利用其处理油脂所具有的高浓度、纯天然、无毒、无腐、无刺激，无二次污染且易繁衍驯化等特点达到降解餐余油脂，最终转化为有机酸。 课题最初是将取自数家餐馆排污渠的污泥样品经过稀释、分离出15种不同菌种。为得到课题目的所需菌种，我们首先以普通营养琼脂培养基进行对菌落的富集、培养及筛选，选出10种生长能力较好的菌种，并保留菌种。然后以植物油为唯一碳源，配制中性红油脂营养琼脂培养基，将10种菌种植入其中，通过富集、培养及观察，发现有3种菌对油脂有一定的分解能力，同时通过中性红指示剂的作用，发现其中一种菌的在中性红油脂营养培养基中显示的红色较深。再使用pH酸度计对菌液和蒸馏水的pH值进行对比，可以确定该菌种可以分解油脂。 在进一步精细研究后，此菌株将不仅能对解决泔脚问题有所帮助，更能使用生物技术为人类服务，创造美好的未来。 三、材料和方法 3.1材 料 3.1.1 菌种样品：从学校后门附近餐馆排污渠的污泥中选取一定量作为样本，分别编号为I及II。 3.1.2 培养基： 营养琼脂培养基（牛肉膏 0.3g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g,琼脂1.5g,水100ml,pH 7.0—7.2） 中性红油脂琼脂培养基 (蛋白胨1g,NaCl 0.5g,琼脂1.5g,中性红0.7ml,花生油0.07g,吐温80 2-3滴,水100ml,pH 7.0—7.2 ) 实验仪器： 精密移液器、pH酸度计、涡轮振荡器、电子天平、高压灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作室 3.2方 法 3.2.1 实验一：菌种取样和菌液稀释 ① 从污泥中选取10g样本，置入100ml无菌蒸馏水中，经涡轮振荡器振荡2分钟左右配制成10－1母液。 ② 用精密移液器将5ml母液加入到95ml无菌蒸馏水中，则稀释成10－2.。经涡轮振荡2分钟左右后，用相同的方法稀释到10－3、10－4。 3.2.2 实验二：富集及分离 ① 营养琼脂平板中培养： 吸取稀释度为10－4的菌液0.2ml注于无菌营养琼脂培养基平板上，每个稀释度接种两个平板，置于37℃恒温培养箱内倒置培养一天后记录菌落总数。 ② 指管中进行分离： 将生长较好的菌株按照菌落形态颜色等表观特征分别接种到营养琼脂指管中进行分离培养。 数量：10支，分别编号为a1～③ 观察及保存： 培养一天后发现菌株生长情况良好并做冷藏保存。 3.2.3 实验三：进一步分离及纯化 ① 中性红油脂营养琼脂培养基平板中培养： 将上一步实验得到的指管中的菌株分别接种到无菌中性红油脂营养琼脂培养基平板中，放入37℃恒温培养箱中进行倒置培养一天。 数量：15支，分别编号为w1～② 在培养基中进行分离及纯化： 观察到15个培养皿中有7个培养皿中的菌落出现红色，分别是w1两个,w5两个,w6一个,w7两个。其中w1，w5，w7红色较为明显，其它培养皿中有大量菌落出现，但培养基无变红现象出现。（注：这一步实验曾经重复7次，都没有进展。最后发现是由于中性红浓度问题，通过设计新的一组实验找出合适的中性红浓度后才使这个实验得以继续，有关中性红浓度问题的解决及实验过程将单独列出）。 将w1,w5,w6,w7菌种接入营养琼脂培养基指管并保存。同时将指管中的w1,w5,w6,w7菌种再次接入无菌中性红油脂营养琼脂培养基平板中（每种菌种×2）放入37℃恒温培养箱中进行倒置培养一天。 培养一天后观察到有3个培养皿中的菌落现出的红色最为明显，分别为w7两个,w6一个。 将w6和w7菌种接入营养琼脂培养基指管并保存。同时将指管中的w6和w7菌种再次接入无菌中性红油脂营养琼脂培养基平板中，放入37℃恒温培养箱中进行倒置培养一天。又重复上述试验2次，最终确定w6,w7号菌种可能是试验所需菌种 ③ 观察及保存： 通过实验三筛选出可能对油脂有分解能力的菌种w6和w7,接入营养琼脂培养基指管并保存。 3.2.4 实验四：在中性红油脂琼脂培养基中培养 ① 中性红油脂琼脂培养基中培养： 将指管中纯化的菌株分别接种到9个无菌中性红油脂琼脂培