有机酸提取鮰鱼皮胶原蛋白的工艺研究.doc

有机酸提取鮰鱼皮胶原蛋白的工艺研究 陈丽丽1 赵利1( 刘华1 袁美兰1 苏伟1 邹胜员2 1，江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌，330013 2，江西省水产技术推广站，江西 南昌，330046 摘要 胶原蛋白是一种生物性高分子物质，广泛应用于食品、化妆品、医药工业中。采用酸法对鮰鱼皮中胶原蛋白进行提取，对提取胶原蛋白过程中酸的种类、酸的浓度、料液比、提取时间和提取温度对胶原蛋白提取率的影响进行详细的研究。结果表明，酸法提取鮰鱼皮中胶原蛋白的最佳工艺为0.5mol/L的醋酸作为浸提剂，采用1:50的固液比，在15℃下提取72h，提取率最高为62.05%。同时，测定了鮰鱼皮中胶原蛋白的氨基酸组成。关键词 鮰鱼皮；胶原蛋白；有机酸；提取 胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色，是生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量最佳的生医材料。其应用领域包括医药、化妆品、食品工业、生物合成等领域。目前生产的胶原蛋白制品的原料主要来源是猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱，但因近年来随着全球生态环境恶化导致疯牛病、口蹄疫等许多流行病的发生，使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大[1]。因此，从水生动物鱼体废弃物中提取胶原蛋白已成为当前国内外许多学者研发的一个热门课题。 近年来，淡水鱼的加工和下脚料的综合利用取得了很大的进步，并开发出各类淡水鱼的综合利用产品，淡水鱼产品的加工能力、产量和产值逐年增长[2]，淡水鱼加工废弃物的数量将越来越多，会造成资源的浪费和环境的污染，如何将其变废为宝，是一个急需解决的问题。 本文以鮰鱼皮为研究对象，采用有机酸法对鮰鱼皮中胶原蛋白的提取工艺进行了初步探讨。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 鮰鱼皮 江西鑫海水产食品有限公司，所有的化学试剂均为分析纯。 1.2 主要仪器及设备 磁力搅拌器（常州市华普达教学仪器有限公司），数显恒温水浴锅（江西省金坛市荣华仪器制造有限公司），冷冻离心机（上海中科伍佰豪生物工程有限公司），UV-1100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），电脑恒温层析柜（上海泸西分析仪器厂有限公司），旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。 1.3 方法 1.3.1 鮰鱼皮的预处理 取出冷冻的鮰鱼皮，流水化冻后，仔细地将皮下肉、脂肪及结缔组织剔除，分切成碎片，用10%的异丙醇（1:4）于4℃萃取24h，去除脂肪类物质，用去离子水清洗。然后将脱脂后的鱼皮分别加入浓度为5%氯化钠溶液（1:10），于4℃连续搅拌24h,过滤，用去离子水（1:10）水洗样品并过滤，重复3次，去除鱼皮中的非胶原蛋白。 1.3.2 鮰鱼皮中胶原蛋白的提取 鱼皮胶原蛋白的提取过程均在低于10℃的条件下进行。 向预处理好的鮰鱼皮中加入一定量的醋酸、乳酸和柠檬酸试剂，连续搅拌一定时间，然后用高速冷冻离心机离心（10000r/min，30min，10℃）得上清液即鱼皮胶原蛋白的提取液，冷冻干燥得到胶原蛋白。 1.3.3 胶原蛋白提取率的测定 胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸（Hydroxyproline，以下简称Hyp）和羟赖氨酸在其他蛋白质中很少见[3]，为胶原蛋白所特有。通过测定羟脯氨酸的含量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量[4]。 量取1ml离心后的粗提液和6mol/L盐酸溶液10ml于水解管中，抽真空，用酒精喷灯封管，于110℃的烘箱中水解反应24h后，冷却取出。打开水解管的封口，将水解液移入旋转蒸发管中，蒸干盐酸，用去离子水稀释，定溶到100ml，摇匀，参照文献[5]测定羟脯氨酸的含量。 胶原蛋白的提取率(%)=×100 1.3.4 醋酸提取鮰鱼皮中胶原蛋白最佳工艺的正交试验方案 选取醋酸浓度（A），浸提时间（B），浸提温度（C）和固液比（D）为实验因子，以胶原蛋白的提取率为指标，采用L9(34)正交试验设计，进行酸法提取工艺研究。正交试验方案见表1。 表1 正交试验方案 水 因素 平 醋酸浓度/(mol/L) A 时间/h B 温度/℃ C 固液比 D 1 0.1 24 5 1:60 2 0.3 48 10 1:50 3 0.5 72 15 1:40 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析采用高效液相色谱法AccQ.Tag柱前衍生法。冻干的胶原蛋白中加入6mol/L HCl后真空封管，置110℃烘箱水解24h。水解液加入AccG.Tag衍生剂进行衍生反应，然后将样品上柱分析。 1.3.6 胶原蛋白纯化方法 把鮰鱼皮中胶原蛋白的提取液离心，得到的上清液加氯化钠至2.5mol/L进行搅拌盐析，然后冷冻离心（10000r/min，20min，4℃），