绵羊卵巢组织石切片.doc

绵羊卵巢组织石蜡切片制作条件优化研究 姜晓龙陈建伟姚晓磊赵妙妙吕丽华 (山西农业大学动物科技学院山西太谷030801 ) 【摘要]为观察绵羊正常卵巢组织的形态结构，采用苏术精一伊红(hcmatoxylirrcosin, HE)染色法制作绵羊卵巢 组织石蜡切片。结果显示，在切片制作过程中存在的问题主要包括染色不均、染色对比不明显、过度染色、染色过浅 和切片出现斑点等。在试验过程中可通过充分分化、蓝化、充分水洗等因素的控制来提高切片的染色效果，该方法 可为动物卵巢及卵泡染色切片制作提供技术指导。 关键词:绵羊;HF染色;卵巢;切片;优化 HF染色法是石蜡切片技术中常用的染色法。苏术精 碱性染液可使细胞核内染色质与胞质内核糖体着蓝紫色;伊 红酸性染料可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，作为 组织学、月王胎学、病理学教学与科研中最基木的技术方法而 被]’一泛使用川。 木试验通过HF染色技术制作石蜡切片，该方法是一种多步骤、多因素决定的过程，在试验中由于操作不当，经验不足，以及实践的使用和时间的掌握等诸多因素影响，出现切片脱落、染色不均匀、糊不清、褶皱，及细胞核和细胞质对比不明显等现象，从而影响使用效果。HF染色切片制作过程中出现的问题进行了探究，并提出解决方案，这对相关的试验操作具有指导意义。 1材料与方法 1. 1试验材料 木试验选用山西省清徐县屠宰场成年健康母羊，屠宰后 取卵巢。 1.2主要试剂和仪器 Youin氏固定液、包埋纸盒、染色缸、融蜡箱、切片机、恒温箱、载玻片、小烧杯、吸水纸、移液枪、盖玻片、石蜡，1%盐酸水溶液、0.500伊红(水溶性)溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、苏术精染液、伊红染液、中性树胶、蒸馏水。 1. 3试验方法 1. 3. 1绵羊卵巢的处理:将卵巢投入预先配好的固定液中(1000福尔马林，Youin氏固定液等)，使组织蛋白质变性并防 I I几细胞死亡后自溶或细菌分解。 1.3.2脱水透明:用低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织中的水分，再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精，才能浸蜡包埋。 1. 3. 3浸蜡包埋:将透明处理的组织块置于熔化的石蜡中，放入熔蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。 1. 3.通切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为}^-8 pm薄片。切卜的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放朽。C恒温箱中烘干川。 1. 3.脱蜡染色:染色前，用二甲苯门)脱蜡5min，入二甲苯Ul}中脱蜡 10min，用吸水纸吸干液体;入100%乙醇U)smin，入100%乙醇门1) 5min，用吸水纸吸干液体;入9500乙醇3 min并过流水2 min，用吸水纸吸干水分。苏术精染色} ^-8 min，并用1%盐酸水溶液分化5}-10s，自来水洗返蓝15^-30 min;0. 500伊红(水溶性)染色30 s,95%乙醇门脱水5 min，用吸水纸吸干液体;95%乙醇门1)脱水5 mln，用吸水纸吸干液体;入100%乙醇门}6 min,100%乙醇}ll} 2 min,用吸水纸吸干液体入二甲苯1)中透明2^-3 min，二甲苯Cll)中透明5 min。用移液枪吸取适量中性树胶于载玻片上，盖上盖玻片待凝固后观察结果。 2结果与分析 2. 1正常染色 经显微镜观察，正常HF染色切片见图1-A,l-B。图1-A可见卵巢上有腔卵泡的存在，图1-B可见卵巢卵泡颗粒细胞(GCS、内膜细胞CTC)的细胞核呈蓝紫色;而周围的细胞质、纤维被染成粉红色，切片染色均匀无褶皱，细胞核和细胞质对比明显。 2.2染色异常 在切片制作尤其是染色过程中常会出现染色异常情况，从而影响了正常的组织形态观察。图1-C显示细胞核染色苍白、暗淡，细胞核与细胞质染色对比度差。出现这类问题有三种原因:切片在苏术精染液停留时间太短;苏术精染液过度氧化，失去染色能力;分化步骤处理时间过长。可进行切片重新染色。如果组织在酸性固定液Zcnkcr,Bouin 及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏术精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色。 图1 - I}显示细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质含有大量的苏术精，导致细胞核与细胞质比例失调。这主要是由于在染色过程中切片在苏术精染液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短，造成苏术精染液大量分布而占据细胞质位置。通过显微镜上卜微调观察，如果只有1 }- 2层细胞核层次，说明不是因为切片太厚，可经脱色、漂白、重新染色，对染色和分化时间做些适当的调整。若是由于切片太厚导致的细胞核过染，则需要重新切片。 图1-F显示细胞核呈红、棕色改