实验技术及抗寄虫药物.doc

第五篇 实验技术及抗寄生虫药物 第十七章 寄生虫病原检查技术 寄生虫学诊断技术包括病原检查、免疫学检查和分子生物学检查等三个方面。本节将主要对病原检查的各种技术方法作一较全面的介绍 第一节 粪便检查 粪便检查是诊断寄生虫病常用的病原学检测方法。要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时。如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查，或暂时保存在35°C～37°C条件下待查。盛粪便的容器须洁净、干燥，并防止污染；粪便不可混入尿液及其它体液等，以免影响检查结果。具体方法如下： （一）直接涂片法（direct smear method） 用以检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法简便，连续作3次涂片，可以提高检出率。 1．蠕虫卵检查 滴一滴生理盐水于洁净的载玻片上，用棉签棍或牙签挑取绿豆大小的粪便块，在生理盐水中涂抹均匀；涂片的厚度以透过玻片隐约可辨认书上的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如用高倍镜观察，需加盖片。应注意虫卵与粪便中的异物鉴别。虫卵都具有一定形状和大小；卵壳表面光滑整齐，具固有的色泽；卵内含卵细胞或幼虫。 2．原虫检查 活滋养体检查：涂片应较薄，方法同查蠕虫卵。气温愈接 近体温，滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。 （2）包囊的碘液染色检查：直接涂片方法同上，以一滴碘液代替生理盐水，粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体，可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本，再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊；另一侧查活滋养体。 碘液配方：碘化钾4g，碘2g，蒸馏水100ml。 （3）隐孢子虫卵囊染色检查：目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存（4℃1个月内）的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色，再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下： 金胺－酚（auramine-phenol）染色法： 染液配制：1g/l金胺—酚染色液（第一液）：金胺0.1g，石 炭酸5.0g，蒸馏水100ml；3%盐酸酒精（第二液）：盐酸3ml，95%酒精100ml；5g/l高锰酸钾液（第三液）：高锰酸钾0.5g，蒸馏水100ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，10～15分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置荧光显微镜检查。 低倍荧光镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，呈环状，核深染结构偏位，有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。 改良抗酸（modified acid-fast method）染色法： 染色液配制：石炭酸复红染色液（第一液）：碱性复红4g，95% 酒精20ml，石炭酸8ml，蒸馏水100ml；10%硫酸溶液（第二液）：纯硫酸10ml，蒸馏水90ml（边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中）；20g/l孔雀绿液（第三液）：20g/l孔雀绿原液1ml，蒸馏水10ml。 2）染色步骤：滴加第一液于晾干的粪膜上，1.5～10分钟后水洗；滴加第二液，1～10 分钟后水洗；滴加第三液，1分钟后水洗，待干；置显微镜下观察。 经染色后，卵囊呈玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。如染色（1.5分钟）和脱色（2分钟）时间短，卵囊内子孢子边界不明显；如染色时间长（5～10分钟）脱色时间需相应延长，子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。 不具备荧光镜的实验室，亦可用本方法先染色，然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好，可提高检出速度和准确性。 金胺－酚染色－改良抗酸复染法 用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是：先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察，卵囊同抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成兰黑色，两者颜色截然不同，极易鉴别，使检出率和准确性大大提高。 （二）厚涂片透明法（改良加藤法）（modified Kato’s thick smear） 厚涂片透明法适于蠕虫卵检查。取约50mg（已用100目不锈钢筛除去粪渣）粪便，置于载玻片上，覆以浸透甘油—孔雀绿溶液的玻璃纸片，轻压，使粪便铺开（20×25mm）。置于30～36℃温箱中约半小时或25℃约1小时。待粪膜稍干，即可镜检。 玻璃纸准备：将玻璃纸剪成22×30mm大小的小片，浸于甘油—孔雀绿溶液（含纯甘油100ml、水100ml和1ml 3%孔雀绿水溶液）中至少浸泡24小时，至玻璃纸呈现绿色。 使用此法需掌握粪膜的合适厚度和透明的时间，如粪膜厚透明时间短，虫卵难以发现；如