培训课件-第二章蛋白质的定性定量分析.ppt

3. 注意事项 柱床表面不能干燥 凝胶的选择 Sephadex 溶胀 G值的意义 凝胶柱的再生与保存 第 三 节 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 等电点 (isoelectric point, pI) 两性电解质性质 支持介质 (supporting media) Figure of IEF + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 + – pH 3 pH 7.5 pH 10 Isoelectric Focusing ReadyStripTM IPG Strips 3–10 4–7 3–6 5–8 7–10 3–10NL 3.9–5.1 4.7–5.9 5.5-6.7 6.3-8.3 High-purity monomers Narrow ranges for resolution of low-abundance proteins Overlapping gradients for “cyber gels” Three lengths 7 cm, 11 cm and 17 cm 0.5 mm x 3.3 mm Broad Range pH 3-10 Narrow Range pH 4-7 Micro Range pH 4.7-5.9 3 10 4 4 7 7 4.7 5.9 4.7 5.9 注意事项 两性电解质的选择 电极缓冲液 对样品的要求 样品必须无盐 加样的量要适当 加样方法 加样位置 第四节 蛋白质的免疫印迹分析 印迹技术 (blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术 1975年，Edwen Southern提出了分子印迹(渍)的概念 目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测 印迹技术的类别及应用 DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术 (immunoblotting) 一、免疫印迹分析的应用 对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析 生物大分子相互作用分析 将蛋白质固定在膜上的其他应用 结构域分析 斑点印迹 抗体纯化 为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原 蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析 二、免疫印迹分析的基本流程 电泳分离蛋白 转移至固相膜 封闭非特异结合位点 与第一抗体温育反应 与第二抗体交联物温育反应 显色 制备蛋白样品 蛋白质转移 抗体检测 免疫印迹操作流程图 1. 样品的制备 组织或细胞中提取 裂解 去污剂 (SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20) 蛋白酶抑制剂 (PMSF、EDTA、Pepstatin、 Leupeptin、Aprotinin) 蛋白质的定量 (Bradford、BCA、Lowry) 基因工程表达重组产物 2. 电泳分离 SDS非变性PAGE EIF 3. 蛋白质的电转移 方法：半干法、湿法 作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡 ！？ 常用的蛋白质转移膜 种类 微孔大小 结合能力 特点 NC膜 0.45 um 80-100 ug/cm2 应用广泛 20kD易丢失 PVDF膜 0.22 um 0.45 um 80-100 ug/cm2 170-200 ug/cm2 20kD不易丢失 容量大、强度高 尼龙膜 480 ug/cm2 用于核酸 电转移装置 电转移示意图 电转移装置 4. 靶蛋白的免疫学检测 封闭 — 对转移膜上的潜在结合位点进行封闭 ，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色 BSA、脱脂奶粉 靶蛋白与第一抗体反应 — 单抗、多抗 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等 作用：排除假象 与第二抗体反应 第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记 酶标抗体常用酶： 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase