第二章目标产品分析检测及质量控制.doc

第二章(1) 目标产品的分析检测及质量控制 蛋白质分析检测技术与质量控制 按照美国食品与药品管理局（FDA）的要求，对于基因工程产品—蛋白质，除了确定其纯度外，还要对其物理化学性质进行表征，必须取得以下数据： 分子量、溶解度、等电点、氨基酸序列、肽谱、二硫键配对，糖脂电泳谱图，二级结构、三级结构，与内源性物质的关系，受体的分布及结合等。基因工程产品生产过程中不允许有SDS参与。 蛋白质的含量和纯度 蛋白质的含量 经典的方法：紫外法 Lowry法BCA法：Pierce已有供应 考马斯亮兰G-250 纯度检测 纯度要求：95%、99%，99.9% 目标蛋白的分离、分析方法: 凝胶电泳技术：聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS — PAGE、等电聚焦、二维凝胶电泳 等电聚焦：不同的氨基酸组成不同的蛋白质，又不同的等电点。在偏离蛋白质等电点的介质中， 蛋白质带负电或者带正电，此时，蛋白质会在电场作用下分别向正极或负极迁移，当达到其等电点的位置时，蛋白不带电，迁移停止，这就是等电点聚焦电泳的基本原理。 等电聚焦电泳的关键取决于凝胶：IPG 试剂— 是拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种；丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，他们构成了pH 3~10的缓冲体系。 IPG胶：根据一定的配比，将IPG 试剂以一定的比例加到混合物中用于凝胶聚合， 从而形成不同pH值梯度的凝胶条。APE 公司和BIO-RAD 公司均有IPG胶商品出售。IPG胶的优点：机械性能好、重现性好、 易处理、上样量大等优点，而且避免了电渗作用，可以进行特别稳定的IEF分离。 二维电泳（2DE）基本流程：（1）第一向 等电聚焦凝胶电泳（2）第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（3）凝胶显色 二维电泳（2DE）的优点分辨能力可达1万个点（30cm ?40cm）分辨能力可达3000个点（ 20cm ?20cm）。二维电泳得到的是构成蛋白质各个亚基的图谱，而非完整的功能蛋白质图谱。胶上蛋白检测的灵敏度取决于染色剂 2DE存在的问题：低丰度蛋白的检测；极酸和极碱性蛋白的分离，目前最多能分离pH3~11范围内的蛋白质；高分子量区的蛋白分离困难（分子量大于10万） 膜蛋白或疏水蛋白的分离困难 操作过程难以实现自动化 用于蛋白质、肽分离的色谱技术：反相色谱、离子交换色谱、疏水色谱、体积排阻色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、 毛细管电泳：以电场为驱动力，在毛细管中按溶质糖度或/和分配系数的不同进行高效、快速分离的技术 。包括：毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管电色谱 分离的灵敏度取决于检测器：紫外检测器：pmol级；激光诱导荧光检测器：实现单分子检测；凝聚或核光散射检测器；质谱检测器；核磁检测器； 色谱或电泳技术的特点：高效、快速，自动化程度高，定量准确，可直接与质谱联用进行定性分析 虽然色谱或电泳技术可以克服凝胶电泳的很多缺陷，但在分离容量上还不及凝胶电泳。纯度的鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS — PAGE、毛管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC（包括凝胶过滤、各种反向HPLC、离子色谱、疏水色谱等）、质谱法：电喷雾质谱（ESI），灵敏度Pmol、溶解度法：纯的蛋白质在一定的溶剂中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在溶剂中未溶解固体的数量。 注意： 仅用一种方法鉴定蛋白质的纯度是不够的，至少利用两种以上不同分离机理的方法来判断蛋白质的纯度才比较可靠。 蛋白质分子量的确定：凝胶筛分（体积排阻色谱）：测定完整蛋白质的分子量；SDS：测定蛋白质亚基的分子量，用量约1(g，误差：5-10%；毛细管电泳：分辨率和准确性高于SDS，用量ng级；质谱：电喷雾质谱（ESI）、基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-TOF），精确度0.01%； 等电点：等电聚焦法：既可以测定蛋白质的等电点，又可以鉴定蛋白质的纯度，是一种一举两得的方法。 IEF—聚丙烯酰胺等电聚焦电泳cIFF—全液相毛细管等电聚焦电泳cIEF—毛细管等电聚焦电泳-电喷雾色谱技术分辨率极高，能分辨的等电点差异小于0.04pH单位。 肽谱及蛋白质序列测定： 肽谱技术：是指蛋白质被酶或化学降解后肽段的分离分析或制备。 1、裂解：酶裂解和化学裂解2、肽谱分析（指纹术）：SAS、HPLC、CE、MS 蛋白质序列：微量液相脉冲蛋白质/多肽自动顺序分析仪，灵敏度1pmol，检出极限为20fmol。 LC-MS/MS对蛋白的全序列进行测定一般需要1-2天时间 其它：1.蛋白质的二硫键分析：目前有同位素标记、化学修饰、质谱定位等方法来确定分子内和分子间的二硫键。 2.蛋白质翻译后修饰的分析：蛋白质的磷酸化和糖基化等，主要使用质谱法确定。质谱法可通过特征离子监