计算机在生命科中的应用第四次作业2.doc

对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 前言： PCR技术的的运用，要点包括三部分，模板、引物和体系。模板是扩增的基础，引物是PCR技术的关键点，在现在实验条件下，模板和体系一般都有商品化的技术支持，因此，能否设计出好的引物就成了PCR反映的关键 1.利用软件Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的较小的片段 2.利用软件Vector NTI Explore进行引物设计引物 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA 序列。 3. 引物设计的原则： （1）长度在18~35bp，GC含量在40%~60%之间，内部无发卡结构，Tm值接近72℃； （2）引物之间避免形成二聚体； （3）引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； （4）在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。 （5）引物3′端不能选择A，最好选择T。 （6）引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 实验内容： 试验中用到的古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是要得到的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到1——1429的DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。 实验步骤： 1, 要用限制性内切酶将多余的片段切去。找出目的基因所在的片段 这是Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件Vector NTI所能找到的所有酶切位点： 由给出的切割位点课已看出，在整条基因序列中PstI的切割微点只有一个，所以首先用此限制酶切割，可以得到3370bp之前的整条片段。这样做既不会切断需要的那一段基因序列，又可以切除掉大部分的不需要的片段。切完后，进行琼脂糖凝胶电泳法进行电泳，可以得到下图： ， 同理可将1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图。用工具找它的ORF，ORF的分析结80~709bp处， 1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATT TTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101 GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAAT CCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201 ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAA TATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTT AvaI ~~~~~~~ 301 GGTAAAAGGG GGTTATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTA