变形梯度凝胶电泳.doc

变性梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE），是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢。由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用的分子标记方法。 DGGE最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，并证实了这种技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。这一技术能够提供群落中优势种类信息，并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点，适合于调查种群的时空变化。而且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析，鉴定群落组成。DGGE通过逐渐增加的化学变性剂线性浓度梯度，可以把长度相同但只有一个碱基不同的DNA片段分离。 作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。 DGGE的基本原理及方法： DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同，从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。 DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤：核酸提取、16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。有些学者通过克隆、测序建立微生物区系的16SrRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息，但这种方法相对于指纹图谱技术来说，费时费力，价格也相对昂贵。 核酸提取：微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础，是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细胞裂解有三种：机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等；化学法包括加入SDS、苯酚等；酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合，发现组合后提取总DNA 的效果较好。Stahl等（1988）在含有SDS和酚的体系中加入适量的玻璃微珠，机械法裂解瘤胃样品中的菌体细胞。Zhu等用酶法和玻璃珠相结合的方法提取鸡盲肠内容物的微生物总DNA。核酸抽提一般用酚-氯仿-异戊醇抽提，这种方法对去除杂蛋白有良好的效果。Reichardt等（1994）认为， CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法也是常用的方法，不需要贵重仪器，操作较为简单，能广泛适用于各种植物的核酸提取，纯度也能满足许多分子生物学操作的要求，所以使用日趋广泛。 16SrRNA基因序列的PCR扩增：细菌按沉降系数分为5S、16S和23S三种，16SrRNA基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。16SrRNA基因序列全长1540bp，有保守区和可变区之分，每种细菌的保守区都是相同的，能反映生物种类的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；可变区因细菌种类而异，通过保守区设计引物，扩增出可变区，就可以得知微生物多样性信息。大多数情况下，可根据16SrRNA V3区和V6-V8区设计细菌特异性引物进行PCR扩增，有时为了更加准确得获得微生物多样性的信息，可先通过细菌16SrR