报告基因检测.doc

荧光素酶报告基因 原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。 其原理简述如下： （1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。 （2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。 （3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。 步骤： 1 铺细胞于 24 孔板中， 选用48孔板（如果比较难做的系统可以选用24孔板甚至12孔板，细胞量越多表达的酶相应越多），铺板密度约为30%（如果比较着急做实验，密度可以提高）。 每孔细胞数为 20 万细胞左右，待细胞融汇度达到70% （适合磷酸钙转染）、 85% （适合脂质体转染）时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染（因为转染后要让质粒表达一定的时间，一般是18-24小时，故而这个细胞密度到加药时密度会差不多到100%）。转染体系的配置：目标蛋白的质粒（pBind-），luc质粒，fermentas转染试剂，（质粒：转染试剂 1：1-3（μg：μL）这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。 脂质体法 （1）在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基（无血清培养基Opti-MEM）为细胞换液。（2）将适量欲转染的质粒DNA与适量体积的 Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体也和适量的 Opti-MEM混合。室温静置5分钟。（3）将（2）两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀。静置20分钟。 （4）将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37培养（5% CO2，37 ）。 脂质体法各试剂用量 DNA ug 培养基（μ） 脂质体（μl） 培养基（μl） 96well 0.2 20 0.5 20 24well 0.8 50 2.0 50 12well 1.6 100 4.0 100 3.5cm 4.0 250 10.0 250 6cm 8.0 500 20.0 500 10cm 24 1500 60.0 1500 —加荧光素酶试剂 1）5X lysis in ddH2o ，稀释到1X。 60ul X 51 48孔板 3060ul ddH2o 2448ul lysis 5X 612ul 每孔60ul 裂解细胞， 于-80°C 10min , 4°C 10min ,反复冻融易于裂解。 2）firefly luciferase substrate 50 ul X 51 2550ul luciferase 1X 2290 ul Luci 棕色管 10X 255 ul ATP 500X 5 ul 每个孔加50 ul luciferase于双报告基因仪器检测。 3）Renilla substrate 50 ulX50 stop buffer CTZ buffer 1X 2225 ul stop（透明管） 10X 250ul slip 棕色管 100X 25ul 再加50 ul relina 于双报告基因仪器检测 6 β - 半乳糖苷酶活性的测定：取 10 μ l 细胞裂解液，加入 120 μ l 下面混合的试剂： 3 μl 100 × Mg （ 0.1M MgCl 2 ）、 66 μ l ONPG （溶于 0.1M 磷酸钠溶液中， 4mg/ml ）、 200 μl 0.1 M 磷酸钠缓冲液（混合 41ml 0.2M Na 2 HPO 4 ·H 2 O ， 9ml 0.2M NaH 2 PO 4 · 2H 2 O ， 50mlH 2 O 配制而成），在 37 ℃ 温育 30 分钟左右，至液体颜色变黄。最后加入 50 μ l Na 2 CO 2 终止反应，测定 OD 420 。 7 荧光素酶的活性和 β - 半乳糖苷酶活性的比值即为报告基因的数值。 3.2 仪器安装