提取DNA方法.doc

3.1.4.1提取基因组DNA所需溶液配制 1. 1mol/L Tris-Cl（pH8.0121.18g Tris碱溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调pH值至8. 0（约4.2ml），1000mL，高压灭菌后室温保存。 2. 0.5mo1/L EDTA：称取EDTA 186.1g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调节pH至8. 0，定容至1000mL，高压灭菌后室温避光保存。 3. 10﹪SDS50g SDS溶于400mL超纯水中，加热至70℃左右，搅拌待完全溶解后，定容至500mL，调节pH至7.2。高压灭菌后室温保存。 4. 1×SET：取8.766g的氯化钠溶于800ml的去离子水中后加入1mol/L的Tris-Cl（pH8.0）50ml，0.5mo1/L EDTA2ml，最后加去离子水定容至1000ml，室温保存。 5. TE：取1mol/L的Tris-Cl（pH8.0）5ml0.5mo1/L EDTA1ml，加去离子水定容到500ml，高压灭菌后室温保存。 6. 1%的蛋白酶K：取100mg蛋白酶K溶于10mL超纯水，-20℃分装保存。 7. 75%乙醇：在750mL无水乙醇中加入250mL超纯水，定容至1000mL。 8. 苯酚/氯仿/异戊醇（25: 24: 1）：在1000ml的烧杯中加入500mL苯酚，480mL氯仿和20mL异戊醇，混合均匀，待用。 9. 氯仿/异戊醇（24: 1）：在500ml的烧杯中加入480mL氯仿和20mL异戊醇，混合均匀，待用。 10. 3M醋酸钠（pH5.2）：取408.1g的三水乙酸钠溶解于800ml去离子水中，用冰醋酸调节pH至5.2，定容到1000ml。分装后高压灭菌后室温保存。 提取DNA: 1. 将毛囊置于1.5ml EP管中，加入200ul 细胞裂解液，再加入20μL蛋白酶K，充分混匀5min； 2. 58℃水浴1h； 3. 加入100ul TE 缓冲液，颠倒混合10 min，静止片刻； 4. 加入200ul酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混合10min，13000r/min离心8min； 5. 吸取上清液转移至另一新的EP管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，轻轻混匀5min，置0℃下30min~1h； 6. 14800r/min离心10min，将沉淀用乙醇（70%）漂洗2次； 第2次漂洗后用离心管再瞬间离心10s，吸取剩余乙醇，自然晾干得DNA，溶于50ul的TE缓冲液中，于-20℃保存。 3.2.1 基因组DNA提取 1. 分离血清 将冷冻血样在常温下（或水浴）解冻，转移至离心管 500ul 中（可分装到小的EP管中），加入1/2 500ul 体积（至等体积）PBS缓冲液，充分混匀5min，然后4℃下12000r/min离心10min，用1000ml的移液器小心的分离出上层血清，留下层溶液。 2. 分离白细胞 重复加PBS缓冲液，离心直至上清液透明，沉淀呈淡黄色。 3. 破碎白细胞 在含有白细胞的试管中加入1×SET1mL，1%蛋白酶K30μL，10%SDS50μL，充分混合后于55℃水浴锅中消化过夜。（一般10-12个h） 4. 提取DNA 向消化后的溶液中加入等体积的Tris-饱和平衡酚，上下摇晃10min，待溶液充分混匀，以10000r/min离心10min，将上清液转移至新的10ml的离心管中，弃去下层苯酚溶液。 5. 重复步骤4一次。 6. 向离心管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合液，充分摇晃10min后再以10000r/min离心10min，吸取上清液至新的10ml离心管中，弃去下层溶液。 7. 在离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分摇晃10min， 再以10000r/min离心10min，吸取上清夜于新的1.5ml的EP 8. 加入2倍体积预冷无水乙醇（提前2h放置于-20℃冰箱）和0.1倍体积的3M醋酸钠溶液，摇晃EP管，基因组DNA会以絮状析出，于-20℃放置30min，加快DNA的析出。 9. 用10000r/min离心10min，弃去上清液。加入1ml75%的乙醇洗涤沉淀。再以10000r/min离心10min，弃去上清液。重复一次。 10.将EP管置于室温，使乙醇挥发干净。待DNA自然干燥后加入少量TE溶解DNA，测得DNA的浓度。根据实际情况稀释DNA。-20℃保存DNA样。