2015酶工程课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 分子筛层析与洗脱曲线 凝胶颗粒 收集蛋白质 蛋白质混合物 大分子 从柱上面加缓冲溶液 小分子 洗脱体积（Ve） 凝胶柱 大分子 小分子 Ve1 Ve2 V0 蛋白质Mr=49,000 洗出液中的蛋白质浓度 洗脱体积（mL） 未知 logMr 洗脱体积与相对分子质量的关系 葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性 品 名 干胶颗粒 直径/μm 得水值 Wf/g.g-1 床体积 /mL.g-1 最适分段分离范围 溶胀所需时间/h 最大流体 静力压/Pa (cmH2O) 球蛋白分 子质量／Da 线性葡聚糖 分子质量/Da 20℃ lOO ℃ Sephadex G-1O 40-120 1.0±0.1 2-3 700 700 3 1 9810(100) Sephadex G-15 40-120 1.5±0.2 2.5-3.5 1500 1500 3 1 9810(100) Sephadex G-25 粗 中粗 细 超细 100-300 50-150 20-80 10-40 2.5±0.2 4-6 1000-5000 100-5000 6 2 9810(100) Sephadex G-50 粗 中粗 细 超细 100-300 50-150 20-80 10-40 5.0±0.3 9-11 1500-30000 500-10000 6 2 9810(100) Sephadex G-75 中粗 超细 40-120 10-40 7.5±0.5 12-15 3000-70000 1000-50000 24 3 4905(50) Sephdex G-100 中粗 超细 40-120 10-40 10±l.0 15-20 4000-150000 1000-100000 48 5 3434(35) Sephadex G-150 中粗 超细 40-120 10-40 15±1.5 20-30 5000-400000 1000-150000 72 5 1472(15) Sephadex G-200 中粗 超细 40-120 10-40 20±2.0 30-40 5000-800000 1000-200000 72 5 981(10) 第六章 酶的分离纯化与性质研究 5）高效液相层析法。 6）利用稳定性差别而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法等。 7）结晶。在蛋白质提纯过程中，当蛋白质达到一定纯度时就可以进行蛋白质的结晶，但结晶样品不一定是纯的，有时酶的第一次结晶纯度低于50%。现在，对蛋白质结晶的兴趣主要在于制备适合于X-射线衍射研究、中子衍射研究的样品。适用于这种研究的最小晶体，其线性大小至少在0.2毫米以上。要让晶体长成这样的大小，必须寻找适宜的条件。 第六章 酶的分离纯化与性质研究 3. 酶的纯度与产量 酶纯化收支表 步骤 酶活力 蛋白浓度 总体积 总活力 总蛋白 比活力 收率 （U/mL） (mg/mL) (mL) (U) (mg) (U/mg) (%) 一般用电泳法检测酶的纯度，最终的纯度标准，当然是唯一的氨基酸顺序，但很少用它来鉴定纯度。 第六章 酶的分离纯化与性质研究 4. 酶分子量的测定 一般采用超离心沉降速度、凝胶层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定酶的分子量。 分子量的测定 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关: LogM=k1-k2Ve （Ve为洗脱体积） 先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。 LogM A B C LogM测 V测 电泳的一般原理 电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。 SDS当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系：Log Mr=a – bmr mr（相