菌种的来源精要.ppt

（三）、诱变育种的一般步骤 (p83) （四）、筛选的方法 随机筛选 形态 理性化筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。 结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。 HD:高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶 AK:天冬氨酸激酶 结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV 营养缺陷型：如Thr缺陷型 黄色短杆菌F9-50的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l F6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/l F9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l 三、基因的直接进化(directed evolution) 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传 步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 主要应用： 酶学性能的提高: pH 温度 有机溶剂 生理环境→工业催化环境 底物专一性 脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯 例： PLA PLA光学拆分选择性(%) 2 31 57 75 81 90 5次错位PCR 2次定点突变 Reetz (1997) Liebeton(2000) 第二章 菌种的来源 定点突变 错位PCR DNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX XX X X XX X XXX X XX X XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select best with DNAseI fragments recombinants Repeat for multiple cycles DNA shuffling 项目 进化速度 进化对象 进化 周期 影响对象 突变效率 常规定向进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 低 DNA Shuffling 快速进化 特定基因/ 操纵子/病毒 几天 部分基因组 高 DNA Shuffling与常规定向进化的比较 类 型 示 例 特 性 活性增加倍数 潜在应用领域 抗 体 人源抗体 亲和性 400 生物制药 酶 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10，000 生物制药 β -内酰胺酶 抗生素抗性 32，000 抗生素 枯草杆菌蛋白酶E 耐热性 65℃耐热时间 17 200 工业酶 细胞因子 人类干扰素 抗病毒 285，000 基因治疗 肿瘤抑制因子P53 37℃半衰期 12 基因治疗 代谢途径 砷酸盐代谢途径 砷酸盐解毒 40 生物制药 汞代谢途径 汞解毒 12 生物制药 部分DNA Shuffling技术的研究成果 本章小节： 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力； 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工