2.学会用苔黑酚法测定rna含量。.ppt

一、实验目的 1.掌握RNA提取的原理及方法。 2.学会用苔黑酚法测定RNA含量。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多（酵母含RNA约2.67-10%），RNA可溶于碱性溶液，再用乙醇沉淀得到RNA粗制品。将RNA粗制品经过硫酸水解后鉴定其成分及定量。 RNA水解产生的核糖、嘌呤碱和磷酸可用下述方法鉴定： 1. 嘌呤与硝酸银共热产生嘌呤盐基银化合物的白色絮状沉淀。 2. 核糖在浓盐酸中，与苔黑酚（3,5-二羟甲苯）及高铁盐酸试剂共热产生特殊的绿色（670nm定量）。 3. 磷酸与钼酸铵试剂作用产生磷钼酸，后者在还原剂抗坏血酸（或硫酸亚铁）的作用下形成蓝色的钼蓝（660nm定量）。 三、主要器材及设备 沸水浴（铝锅） 天平 离心机 布氏漏斗及抽滤装置 5.分光光度计（670nm）比色皿40个 pH试纸（5-7） 计算纸（9 cm×9 cm） 四、试剂材料 1. 酵母粉 200g 2. 0.2% NaOH 2000mL 3. 乙酸 （滴瓶） 600mL 4. 95%乙醇 400mL 5. 乙醚 2-3瓶 6. 浓氨水 1瓶 7. 5% AgNO3 150mL 8. 苔黑酚-FeCl3溶液 400mL (用前配制) 100mg苔黑酚溶于100mL浓HCl ，再加入100mg FeCl3·6H2O 9. 定磷试剂 100mL （1）17% H2SO4 （2）2.5% 钼酸铵 （3）10%抗坏血酸溶液（棕瓶，淡黄可用，深黄失效， 4℃，1个月） 临用前按下混合： （1）：（2）：（3）：H2O = 20：20：20：40 10. 酵母RNA 100μg/mL 11. 10% H2SO4 200mL 五、实验操作 1. 提取 称8g干酵母于250 mL锥形瓶，加入0.2%NaOH 40mL沸水浴30min，常搅拌。冷却后加入约5滴乙酸（使pH 5-6），转移到离心管中离心，4000r，10min。 量取上清，缓缓加入2倍体积的95%乙醇，边倒边搅，待沉淀完全（静置片刻），再离心，3000r，3min，弃上清。向沉淀中加适量95%乙醇（10mL）搅散转移到布氏漏斗抽干，重复一次。用乙醚洗沉淀2次。干滤渣即RNA粗制品，称量并记录总量（M）。 准确称量50mg干滤渣（M2）用于苔黑酚法测RNA含量，其余的干滤渣用于以下鉴定 五、实验操作 2. 鉴定 将用于鉴定的干滤渣转移到锥形瓶中，加入10%H2SO4 5mL，煮沸2min后鉴定组分。 （1）嘌呤碱 用试管取1mL水解液，加入2mL氨水，再加入1mL AgNO3，观察 （2）磷酸 用试管取1mL水解液，加入1mL定磷试剂，沸水浴，观察 （3）核糖 用试管取1mL水解液，加入2mL FeCl3-苔黑酚溶液，沸水浴10min观察 五、实验操作 3.苔黑酚法测RNA含量 （1）配制样品溶液：将M2用蒸馏水配成1mg/mL (即50 mg/50mL)，取1mL稀释10倍后，取1 mL用于定量，使浓度在10-100μg/mL范围 （2）制作标准曲线及测定样品的浓度，并在标准曲线上查找样品的质量 （3）计算 50mg干滤渣（M2）中RNA含量： W1= M1 / M2 × 500 ×10-3 × 100% 转换成酵母干粉中RNA含量： W= M / 8 × W1 × 100% M： 总的干滤渣 （g） M1 ：稀释后样品在标准曲线上查找的质量 （μg） M2 ：干滤渣 （50mg） 500： 稀释倍数 8 ： 称取的干酵母粉 （g） 五、实验操作 3.苔黑酚法测RNA含量 注意事项 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。 利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。 地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。