3.2细菌的荚膜染色实验解析.ppt

细菌的荚膜染色 * 实验目的与要求 继续学习微生物制片方法 学习并掌握荚膜染色的基本原理和方法 某些细菌生长到一定阶段，在一定营养条件下可向细胞壁表面分泌一层松散透明、疏松、柔软、粘液状或胶质状的物质，即为荚膜（Capsule）。 荚膜的化学成分：主要是多糖、多肽、蛋白质、脂以及由它们组成的复合物—脂多糖、脂蛋白等。 荚膜的功能：是细胞外碳源和能源性贮藏物质，能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，抵御宿主吞噬细胞的吞噬。 细菌荚膜与生产生活：葡聚糖、黄原胶的提取，龋齿、面包发粘，等。 细菌的荚膜 染色原理与说明 荚膜的化学成分对染料结合力很弱，不容易着色，而且可溶于水，易在水洗时被除去。所以，一般采用衬托染色法（负染色法）使菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成一透明圈（即荚膜）。 荚膜很薄，涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形。 荚膜富含水分（90%以上），制片时应自然干燥，不可加热固定，以避免荚膜受热失水收缩而变形，影响观察。 材 料 细菌培养物：胶质芽孢杆菌（或钾细菌） 染色液与试剂：Tyler染色液、绘图墨水（必要时滤纸过滤后再用）、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20% CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯 器材：载玻片、盖玻片、接种环、擦镜纸、吸水纸、显微镜、废液缸、等。 方 法 负染色法 湿墨水法 干墨水法 Tyler法 负染色法 制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。? 干燥：将涂片放在空气中晾干，或用电吹风冷风吹干。? 染色：在涂面上加复红染色液染色2～3min。? 水洗：用水洗去复红染液。? 干燥：将染色片放空气中晾干，或用电吹风冷风吹干。? 涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右拖展，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。? 镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。 结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。? 制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。? 加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。? 镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。? 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。? 湿墨水法 制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。? 制片：左手执载玻片，右手拿一边缘光滑的盖玻片，使其一边与菌液接触、菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。? 干燥：空气中自然干燥。? 固定：用甲醇浸没涂片，固定1?min，立即倾去甲醇。? 干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。? 染色：用甲基紫染1—2min。? 水洗：用蒸馏水轻洗，自然干燥。? 镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。? 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。? 干墨水法 涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。? 干燥：在空气中自然干燥。? 染色：用Tyler染色液染5~7min。? 脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）→用吸水纸吸干→立即加1~2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。? 镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。? 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。? Tyler 法 涂片方法 加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。? 应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。? 在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。 注意事项 作业思考题? 绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在 荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？ 试比较四种荚膜染色法的优缺点。 ?