β-葡萄糖苷酶的研究(中文).doc

β-葡萄糖苷酶的研究 来源： ??添加时间：2011/2/24 13:43:00 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶 EC 3.2.1.21 的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。 β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶 EC 3.2.1.21 的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌 Flavobacterium meningosepticum 、约氏黄杆菌 Flavobacterium johnsonae 等，真核生物来源的有清酒酵母 Candida peltata 、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、 猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-葡萄糖苷酶的进一步纯化，往往是根据具体情况，采用多种方法逐步分离。目前分离β-葡萄糖苷酶的方法较多，其中离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析两种手段结合使用最为普遍，多数是先离子交换柱层析，后用凝胶过滤柱层析。离子交换柱层析方法中常用的是阴离子交换层析，如DEAE阴离子交换层析；同时，阳离子交换层析法也有一定的使用。除上述两种分离方法外，也有其它层析方法用于分离β-葡萄糖苷酶，如使用疏水层析法和羟基磷灰石层析法等。此外，也有人采用双水相萃取和亲和层析的方法来分离β-葡萄糖苷酶，但关于这方面的研究报道较少。 2.3 β-葡萄糖苷酶活性测定方法 β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷 pNPG 、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定， 方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性。由于测定葡萄糖含量的方法很多，也有人通过测定葡萄糖含量来确定酶活力。孙迎庆等用多种方法测β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖为底物，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定产生的葡萄糖量的方法来确定β-葡萄糖苷酶活性；用水杨苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和葡萄糖，然后将酶解产物中的水杨醇用4-氨基安替吡啉作显色剂显色，用分光光度法在515 nm下比色测定β-葡萄糖苷酶活性。 3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质 不同来源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等电点、最适反应pH值、pH值稳定性范围、最适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别（见表1）。 3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小 β-葡萄糖苷酶由于其来源不同，它们的相对分子量也可能不同，而且它们的结构和组成也有很大差异。β-葡萄糖苷酶的相对分子量范围一般在40～250 kDa之间，而其结构可能是由单亚基、双亚基或多亚基构