培训课件--药物特殊毒性评价.ppt

③uvrB缺失的鉴定（紫外线敏感试验） uvrB缺失，即切除修复系统缺失 ④R因子的鉴定：带有R因子的菌株具有抗氨苄青霉素的特性 菌株鉴定 一、Ames试验 （2）自发回变数测定 受试菌株在保存或培养过程中，能产生自发回变 （3）对鉴别性致突变物的反应 经过体外代谢活化系统后的自发回变数，要比不 经体外代谢活化系统的自发回变数略高。 菌株鉴定 一、Ames试验 决定药物最高剂量的标准是药物对细菌的毒性和 溶解度。 西药最大剂量可达5mg/皿，中药可超过5mg/皿 最低剂量0.2 μg/皿. 至少5个不同剂量 每剂量间隔不差过5倍 每个剂量应做3个皿 可用水、二甲基亚砜(DMSO)或乙醇做溶剂 一、Ames试验 3.[试验设计] DMSO≤0.4 ml；乙醇≤0.1 ml 对照组 阴性对照组 阳性对照组 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行加S9 与不加S9的对照 一、Ames试验 应用诱导剂处理后的S9进行体外代谢活化试验 ，即在加S9和不加S9混合物平行条件下测试。 为何要制备S9 ？ 为何要诱导制备S9 ？ 代谢活化 一、Ames试验 S9代谢活化系统：经诱导的大鼠肝脏匀浆，离心后所上清即为 S9上清液，再向其中加入一些辅助因子，如辅酶II（NADP）、 6-磷酸葡萄糖、K+/Mg2+等，组成混合液，从而构成还原型 辅酶II再生系统。肝S9的成分主要是混合功能氧化酶，大多 数化合物在体内经过其代谢。 一、Ames试验 (1)掺入法： (2)点试法： 5.[结果评价] 报告的试验结果应是2次独立实验的重复结果。 判断是否是致突变物？ 4.[方法] 一、Ames试验 （1）掺入法： Rt/ Rc=诱发回变菌落数/自发回变菌落数 2为阳性 (2)点试法：凡在滤纸周围长出一圈密集的回变菌落，该药物即为致突变物质。 如在平皿上出现少数散在的自发菌落，则为阴性 一、Ames试验 二、 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 中国仓鼠肺（CHL）细胞（推荐）、卵巢（CHO）细胞 [原理] 具有遗传毒性的物质作用于靶细胞引起较大范围的DNA损伤，可出现染 色体水平变化。制备中期分裂相染色体标本，在光镜下可直接观察染色 体数目和形态的改变。通过检测受试物诱发体外培养的哺乳动物细胞染 色体畸变能力，从而评价受试物的遗传毒性及其强度 [试验设计] 1.试验至少设4个剂量组 2.最高剂量组的细胞存活率为10%-20% 3.无毒性受试物最高剂量组不超过10mmol/L或5mg/ml 4.应设空白对照、阳性对照和S9对照 用细胞遗传学方法检测受试物是否影响DNA结构 或改变遗传信息的实验过程，从而判定受试物的遗 传毒性 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 [方法] 1.在培养72小时的细胞中一次加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液不足）及一定量不含血清的培养液，混匀后继续培养24h收获细胞 2.收获细胞前加入秋水仙碱作用4小时 3.用胰蛋白酶溶液消化并收集细胞，加入KCL溶液低渗处理10min 4.离心后，用甲醇/冰醋酸液固定2次 5.常规底片，染色，清洗，晾干 6.每组选100个染色体分散良好的中期分裂相细胞进行染色体畸变分析 哺乳动物胞染色体畸变试验 [结果及判定] 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞和染色体结构，计算结构突变及多倍体出现率。 阳性结果判定标准： 1 染色体畸变数增加与药物剂量有关，单剂量组按下表判定 2 某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加 畸变率 结果 5% － 5% ± 10% ＋ 20% ＋＋ 50% ＋＋＋ 三、微核试验 [原理] 骨髓细胞经致突变物作用，其染色体可发生畸变以致断裂。其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普通细胞核小，故称之为微核（micronucleus）。观察骨髓细胞中的微核率，有助于检验药物是否具有致突变作用。 虽然骨髓和外周血各种有核细胞中均可见到微核，但只有在无核的红细胞中才易辩认。在骨髓中无核红细胞有嗜多染红细胞（晚幼红细胞）和成熟红细胞两种，正常情况下，嗜多染红细胞占多数。由于毒性物质影响了骨髓红细胞尤其是嗜多染红细胞，使二者比例失衡，故在骨髓涂片中一般均在嗜多染红细胞中进行观察。 微核试验 [动物] NIH小鼠，6只/组（雄性）或10只/组（雌雄各半）， 。 [给药剂量及途径] 高、中、低三个剂量；高剂量以LD50/2为基准；低剂量应结合药效学及临床用量；一般单次给药。 [对照]