实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测.docx

细胞生物学实验实验72015/4/27 实验7小鼠腹水瘤细胞裂解及乳酸脱氢酶活性检测 姓名：李思露 学号：131140040 实验目的 1．了解裂解细胞的意义。 2．了解及掌握哺乳动物细胞常用裂解方法及裂解效果检测方法。 实验原理 反复冻融、超声及去污剂处理均可导致细胞裂解。不同细胞裂解方法所产生的裂解效果及对细胞蛋白活性的影响不同。细胞裂解效果可通过形态学方法及胞内标志蛋白活性反映。 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）为胞浆标志酶，稳定存在于几乎所有细胞的胞浆内。细胞膜破坏后，LDH即被释放到细胞外。定量检测细胞悬液离心后上清液中乳酸脱氢酶的活性即可反映细胞膜破碎的程度及对胞浆蛋白活性的影响。 LDH检测原理：LDH催化底物形成可与显色剂反应生成有色化合物的产物，通过比色可显示酶活。 实验材料、试剂及器材 （一）材料：接瘤7天的荷腹水瘤小鼠。 （二）试剂： 1． 0.01mol/L，pH7.2PBS。 2． 碧云天RIPA裂解液（强）。 3． 1% Triton X-100溶液：用PBS配制。 4． 乳酸脱氢酶（LDH）测试盒。 （三）用品：普通台式离心机、-20℃低温冰箱、10 mL刻度离心管、胶头吸管、CO2培养箱、96孔板离心机、96孔板、100 μL枪及对应枪头等。 实验操作 1． 准备腹水瘤细胞：抽出荷瘤小鼠腹水，用PBS将细胞浓度调整为1.0×106 /mL。 2． 细胞裂解： （1）冻融： 1.5mL EP管，0.5mL细胞悬液，-20℃冰箱及37℃水浴中反复冻融5次。 （2）去污剂处理： 0.5mL细胞悬液；1500r/min离心8min，弃上清。然后分别作如下处理： 处理1： 0.5mL PBS重悬细胞 处理2： 0.5mL RIPA裂解液重悬细胞， 置4℃冰箱，分别在10、20、30min时取样制备装片观察细胞完整度。 处理3：1% Triton X-100溶液重悬细胞， 4℃静置30min 3． LDH活性测定 （1）离心收集上清：12000r/min离心5min，小心转移上清到干净的EP管。 （2）反应：96孔细胞培养板内进行如下反应： a.20μL待测标本+ 25μL基质缓冲液+ 5μL 辅酶Ⅰ，37℃温育15 min； b.+2,4二硝基苯肼25μL， 37℃温育15 min c.+0.4mol/L 氢氧化钠250μL，室温5 min （3）测定吸光值：450nm测定OD。 实验结果 0.5mL RIPA裂解液重悬细胞， 置4℃冰箱，在10分钟时取样制备装片观察细胞完整度，在显微镜下观察到的视野如下图所示。 图1 RIPA裂解液重悬细胞， 置4℃冰箱，在10分钟时观察到的细胞完整度 LDH活性测定时加入0.4mol/L 氢氧化钠250μL后在96孔板中的反应。 图2 LDH活性测定时加入氢氧化钠后在96孔板中细胞悬液变成棕褐色 450nm测吸光值OD值的结果。 姓名 编号 1 2 3 李思露 A PBS Triton X-100溶液 RIPA裂解液 林静文 B PBS Triton X-100溶液 RIPA裂解液 图3 450nm测吸光值OD值的结果 作业与思考题 比较经PBS、RIPA裂解液、Triton X-100溶液处理后，LDH活性测定值的大小，查阅资料并解释。 答：本组实验结果为，PBS的OD值为0.589和0.557，Triton X-100的OD值为0.494和0.465，RIPA裂解液的OD值为0.540和0.526。下通过单因素方差分析假设检验。 假设检验为： H0：μ1=μ2=μ3（三种处理方式对细胞裂解无影响） H1：μ1、μ2、μ3不全相等（三种处理方式对细胞裂解不同或不全相同） PBS处理 Triton X-100处理 RIPA裂解液处理 0.589 0.494 0.540 0.557 0.465 0.526 ni 2 2 2 均数 0.573 0.4795 0.533 单因素方差分析表 误差来源(Source) 平方和(SS) 自由度(df) 均方(MS) 检验统计量(F) 处理效应 SSA=0.008803 2 MSA=0.0044015 12.8136827 误差 SSE=0.0010305 3 MSE=0.0003435 总效应 SST=0.0098335 5 该F值分子的自由度?组间=2，分母的自由度?组内=3，查方差分析表得F0.05(2,3)=9.55，F＞F0.05(2,3)，则P＜0.05。拒绝H0，接受H1，故可认为三种处理方式对细胞裂解有差别。 三组数据表面看起来相差不大，但通过方差分析可知，三种处理方式是不完全相同的。 经查阅资料知，PBS溶液对细胞裂解几乎没用