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实验十二 食品中蛋白质含量的测定 （一）微量凯氏定氮法李亚东 一原理 蛋白质是复杂的含氮有机物，主要是由碳、氢、氧、氮、硫五种元素组成，由20种氨基酸通过酰胺键（肽键）以一定的方式结合而成。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含量也不同，蛋白质中的氮含量一般为15-17.6%，按16%计算，氮换算为蛋白质的系数为6.25。如玉米、荞麦、青豆、高粱、鸡蛋、肉及肉制品为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其制品为5.71；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。 在食品和生物材料中，还包括有非蛋白质氮的化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、啉和含氮色素等。因此，凯氏定氮法测定蛋白质含量的同时，还包括非蛋白质的含氮部分，故结果称为粗蛋白质含量。 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的有机氮与硫酸结合生成硫酸铵。然后，碱化蒸馏使胺游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以蛋白质换算系数，即为蛋白质含量。称为凯氏定氮法，由于1833年首先提出，经长期改进已演变为常量法、微量法、自动定氮仪法及改良式微量凯氏法等多种。 本法是测定食品中蛋白质的标准方法。 ⑴ 消化 NH2(CH2)COOH+H2SO4 → NH2(CH2)OH+H2O+SO2 NH2(CH2)OH+2H2SO4 → NH3+CO2+2SO4+3H2O 2NH3+H2SO4 → (NH4)2SO4 ⑵ 蒸馏 (NH4)2SO4+2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O 2NH3+4H3BO3 → (NH4)2B4O7+5H2O ⑶ 滴定 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O → 2NH4Cl+4H3BO3 或(NH4)2B4O7+2H2SO4+5H2O → (NH4)2SO4+4H3BO3 二试剂 所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。 1 混合催化剂:硫酸铜10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g，在碾钵中碾细，过40目筛。 2 标准硫酸氨溶液:准确称取重结晶的硫酸铵1.414g，溶解并定容为1000mL。 3 浓硫酸 4硼酸溶液（2%）:临用前取100mL，滴加约1mL混合指示剂，摇匀后，溶液应该呈酒红色。 5氢氧化钠溶液（40%） 6 混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液混合均匀。 7 0.01mol/L盐酸标准溶液（需要标定） 三仪器 1 （改良式）微量凯氏定氮仪 2 凯氏烧瓶 250mL 3 酸式微量滴定管 10mL 四 操作方法 （一）消化 精密称取0.2~0.4g谷物样品，置于消化管中内，不能沾染瓶颈，加入0.5g混合催化剂及3mL硫酸，在放置于通风橱内的消化炉中小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后（该过程大约需要2~3小时），再继续加热0.5h。取下放置冷却后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凯氏烧瓶，洗掖并入容量瓶中，再加水至刻度，摇匀备用。 同时做一空白实验。 （二）仪器的安装和样品的蒸馏、吸收与滴定 1、微量凯氏定氮仪 （1）蒸馏的准备工作 凯氏定氮仪的安装:按照图18—1所示顺序将微量凯氏定氮仪的各部件安装好。要求装得稳妥端正。各部件之间以乳胶管相连，不得漏气。 吸收瓶的洗涤与检查:用作吸收瓶的三角瓶，一定要洗涤干净。先按一般方法洗净，再按图18—2的方法用蒸气洗涤数分钟，冷却后加入2％硼酸指示剂混合液5．o或10．Omi。若瓶中液体呈紫红色(葡萄紫色)，用表面皿盖好瓶口备用。若瓶中液体变绿色，则说明吸收瓶没有洗净，需用蒸气重新洗涤后再用。 凯氏定氮仪的洗涤与检查:在烧瓶(蒸气发生器)内装半瓶蒸馏水，再加浓硫酸及混合指示剂各数滴将瓶中蒸馏水酸化。再加沸石少许。打开自由夹9．关闭夹子11，12，冷凝管通进冷却水，然后将烧瓶内水煮沸，此时产生的蒸气可充分地洗涤仪器。约十分钟后，再换上吸收瓶。吸收瓶中加有lOmL硼酸—指示剂混合液，将冷凝管的出口浸没在吸收瓶液面之下。继续冲洗2—3分钟，若吸收瓶内溶液的颜色不变，则表明该仪器被冲洗干净。然后先移去吸收瓶，关闭自由夹9，打开夹子12。此时，由于贮液瓶受到自然冷却，其内部形成负压，反应瓶内的废液，因受到从冷凝管出口传来的大气压力，而自动地流人贮液瓶中。贮液瓶中的废液，再经打开活塞11即可排出。另外在进行冲洗时，还须同时检查仪器的各个连接部位，以免出现漏气现象。 蒸馏操作练习:为了熟悉仪器的操作方法，用事先配制好的标准硫酸铵溶液代替样品消化液，反复进行蒸馏、滴定和计算，直