抗氧化性方法.doc

1 DPPH 取0.2mL 甲醇，加入0.3 mL样品溶液（浓度50-800ug/mL ,甲醇配制），混匀，加入2.5mL 75uM DPPH（甲醇溶解）溶液，室温放置30min ,于517nm处测吸光值。 清除率 [A0-（A-Ab）/A0]×100% A0：不加入样品，DPPH吸光值（对照） A： 样品和DPPH吸光值 Ab：样品，不加DPPH吸光值 2 O2-· PMS吩嗪硫酸甲酯 NADH 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NBT氯化硝基四氮唑蓝 0.1mL 样品溶液，加入1mL 16 mM Tris-HCl pH 8.0 ---78uM NADH, 1mL 16 mM Tris-HCl pH 8.0 - --10uM PMS ，1mL 16 mM Tris-HCl pH 8.0 - --50uM NBT, 25min保温5 min后于560 nm 处吸光值 。清除率 （1-A样品/A对照）×100%。 3 邻苯三酚自氧化 0.1mL 样品溶液，加入2.8mL 0.05M Tris-HCl pH 8.0 ---1mM EDTA,加入0.2mL 6mM 邻苯三酚。室温迅速振摇，于325nm处每30s 测吸光值至4min。 清除率 （1-样品斜率/对照斜率）×100% 4 FRAP reagent： 10体积300 mmol/L pH3.6醋酸缓冲液,1体积10 mmol/L TPTZ---40 mmol/L HCl 溶液，1体积20mmol/L FeCl3. 1.5mL 新配制FRAP reagent加热至37℃,于593 nm处测空白吸光值。然后加入50uL 样品溶液和150uL去离子水。8min后测吸光值。 FRAP值 样品-空白 2.1 清除羟基自由基（HPLC法） 2.1.1色谱条件 色谱柱：Angilent HC-C18 柱（ 4.6×250mm，5um ; 流动相：甲醇：0.1% H3PO4 30:70;流速：1ml/min;柱温：35℃；紫外检测波长：254nm;进样量：20ul。 2.1.2 方法 取1.5ml 0.18mmol/L对羟基苯甲酸，加入1.0ml蒸馏水，1.0ml 0.3%H2O2,，紫外照射30min前后进行HPLC分析计算清除率。清除率 （空白反应后3,4-二羟基苯甲酸峰面积-样品反应后生成3,4-二羟基苯甲酸峰面积）/ 空白反应后峰面积-空白反应前峰面积 2.2 清除超氧阴离子（邻苯三酚自氧化） 0.1ml不同浓度的多糖溶液，加入5ml 0.05mol/L Tris-HCl buffer pH 8.2 ,25℃水浴10min,加入0.2ml 6mmol/L 邻苯三酚，摇匀后每隔30s,4min内于325nm处测吸光值。 以0.1ml水代替多糖溶液，0.2ml水代替邻苯三酚作参比液，0.1ml水代替多糖溶液作对照溶液，其余同上述方法操作。清除率 （1-样品斜率/对照斜率）×100%。 2.3 清除DPPH 反应体系:1ml浓度不同的多糖溶液，2ml0.6mmol/L DPPH,1ml 95%乙醇，2m0.6mmol/L DPPH加入3ml 95%乙醇作对照液，5ml 95%乙醇作参比，混匀后暗处反应30min,517nm处测定吸光值。 清除率 （1-A样品/A空白） 2.4 分光光度计法测·OH FeSO4溶液（1.8mmol/mL）:称取FeSO4晶体0.2736g，用水定容于100mL容量瓶中，使用时稀释9倍 H2O2（0.3%）：取30%的H2O2 溶液1.0mL ，用水定容于100mL容量瓶中。 水杨酸-乙醇（1.8 mmol/mL）：取水杨酸固体0.2486g，用无水乙醇定容于100mL 容量瓶中，使用时稀释9倍。 向试管中加入一系列不同浓度多糖溶液1.0mL ，FeSO4溶液2.0mL，水杨酸-乙醇1.5mL，最后加H2O2 0.1mL 启动反应，振荡混合，水浴37℃，保温30min,在波长510nm下测量各自的吸光值。以1.0mL蒸馏水代替多糖溶液，其余操作同上作为空白。 清除率 [ A0-As /A0]×100% A0为空白管的吸光度，As为加入样品后的吸光度。