组织裂解液和细胞裂解液的配制.doc

组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制 方法一 一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、 吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70。 4方法二 NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100μg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 μmol/L(0.7μg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3μmol/L(1μg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20保存）裂解操作程序：* 离心收集1×107 个细胞* 加入4预冷1%NP-40裂解液100μl* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4放置15~30min* 4离心，15 000rpm,10min，取上清备用。 ? 方法三 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系· 150 mM NaCl 等渗体系· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂· 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂· 5 μg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂· 5 μg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂· 1% Triton x-100 破坏细胞·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 ? 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系· 150 mM NaCl 等渗体系· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂· 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂· 5 μg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂· 5 μg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂· 1% Triton x-100 破坏细胞·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂·0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，－20保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。 用于普通的 Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂