碱性磷酸酶动力学参数的测定规范.doc

题目：碱性磷酸酶动力学参数的测定 （创新实践活动论文） 2015年月 表2 动力学参数测定试剂用量2 试管号 水/mL 0.04mol/L基质液/mL 碳酸盐缓冲液/mL pH=10碳酸钠缓冲溶液配制酶液/mL 最终基质浓度/（mmol/L） 1 0.9 0.1 0.9 0.1 2.0 2 0.85 0.15 0.9 0.1 3.0 3 0.8 0.2 0.9 0.1 4.0 4 0.75 0.25 0.9 0.1 5.0 5 0.7 0.3 0.9 0.1 6.0 6 0.6 0.4 0.9 0.1 8.0 7 0.2 0.8 0.9 0.1 16.0 8 - 1.0 0.9 0.1 20.0 9 1.0 - 0.9 0.1 - 表3 动力学参数测定试剂用量3 试管号 水/mL 0.04mol/L基质液/mL 碳酸盐缓冲液/mL 去离子水为缓冲溶液配制酶液/mL 最终基质浓度/（mmol/L） 1 0.9 0.1 0.9 0.1 2.0 2 0.85 0.15 0.9 0.1 3.0 3 0.8 0.2 0.9 0.1 4.0 4 0.75 0.25 0.9 0.1 5.0 5 0.7 0.3 0.9 0.1 6.0 6 0.6 0.4 0.9 0.1 8.0 7 0.2 0.8 0.9 0.1 16.0 8 - 1.0 0.9 0.1 20.0 9 1.0 - 0.9 0.1 - 加入酶液后，立即计时37℃水浴中保温15 min。保温结束后，立即加入0.5 mol/L NaOH溶液1.00 mL以终止反应。 各管分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0 mL及0.3%铁氰化钾溶液2.0 mL，充分混匀，放置10 min以9号管为对照，在510 nm处比色，并计算各管的酶活性。用双倒数作图法，在坐标纸上作图，求该酶的Km值。 3 结果与讨论 3.1 标准曲线的绘制 用分光光度计测量每个试管的透光率，再依据公式-logT计算吸光度的值，具体数值见表4 表4 标准曲线参数值 酚含量（μg） 透光率T% 吸光度（ABS） 0 100 0 5 38.6 0.413 10 30.2 0.52 20 18.9 0.724 30 11.2 0.951 40 7.9 1.102 依据表4的数据绘制标准曲线见图1 图1 标准曲线图 得到公式y=0.0312x。 相关系数较小的可能原因为：标准样受到污损，人为操作有误，一起不稳定等。 3.1.2 动力学参数确定实验 按照2.2进行动力学参数测定试验，实验结果见表5，并依据表5的结果进行数据处理，处理结果见表6,7,8。利用表6,7,8的数据，以底物浓度的倒数为横坐标，酶促反应速率的倒数为纵坐标作图，见图2,3,4。计算出动力学参数，得到动力学方程1/V=Km/（Vmax*Cs）+1/Vmax。 表5 不同酶液的T% pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的T% pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的T% 去离子水为缓冲溶液配制的酶液的T% 0.711 0.691 0.720 0.702 0.682 0.709 0.675 0.658 0.706 0.667 0.647 0.705 0.677 0.636 0.685 0.64 0.623 0.666 0.629 0.591 0.655 0.617 0.584 0.645 1 1 1 表6 pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的数据 T ABS D C 1/Cs 1/V 0.711 0.148 4.740 0.790 0.5 18.9 0.702 0.154 4.926 0.823 0.33 18.2 0.675 0.171 5.481 0.914 0.25 16.4 0.667 0.176 5.641 0.940 0.2 15.9 0.677 0.169 5.417 0.903 0.16 16.7 0.64 0.194 6.218 1.036 0.125 14.5 0.629 0.201 6.442 1.074 0.063 14 0.617 0.210 6.731 1.122 0.05 13.3 1 0 0 - - - 图2 pH 8.8 Tris 缓冲溶液配制的酶液的双倒数图 让y=0，则x=-1.085，Km=0.9217mmol/l。 表7 pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的数据 T A