抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达20151203规范.doc

抗昆虫蝎毒素多肽的重组表达研究 韩玉莹, 刘霞, 白占涛 延安大学 摘要：蝎子在进化过程中产生的蝎毒素，主要用于自我防御和捕食，属于活性短肽的分支。抗昆虫蝎毒素多肽作用于众多昆虫细胞膜离子通道，调控通道动力学特性。抗昆虫蝎毒素多肽是潜在的生物杀虫剂，具很高的研究价值。序列分析比对发现，抗昆虫蝎毒素多肽有高保守型，它们序列同源性达67%，其中有6个半胱氨酸残基在位置上相对保守，这可能与其抗昆虫作用有关。由于天然蝎毒素蛋白获取较困难，所以抗昆虫毒素多肽的结构与功能研究也受到很大限制，因此采用基因重组技术获得高纯度蝎毒素重组蛋白尤为迫切。 关键词 蝎毒素、抗昆虫蝎毒素、重组表达 蝎子广泛分布于世界各地，我国普遍生存的是东亚钳蝎（Buthus martensii Karsh, BmK）[1,4]。蝎毒是蝎子体内重要的多肽物质，蝎毒素的多态性和功能的多样性，是各国科学研究热点。抗昆虫蝎毒素是蝎毒素的重要组成部分，其抗虫性在农业应用上具有广泛作用。该类毒素对昆虫具有特异性的毒杀作用，主要作用于昆虫钠离子通道，致使Na+通道持续开放，超兴奋麻痹或致死，对于哺乳动物无害或毒性很小[2]。然而，功能性产业化前提 蝎毒素多肽是多种不同的蛋白和非蛋白类物质混合而成，毒素多肽由28-76个氨基酸残基构成，分为长链蝎毒素和短链蝎毒素。蝎神经毒素是蝎毒素多肽中含量最多的一类毒素，不同的多肽作用于不同的离子通道，引起多种生理反应，根据其作用膜离子通道靶点的不同，分为Cl-通道毒素、Ca2+通道毒素 、Na+通道毒素及 K+通道毒素[5]。 抗昆虫蝎毒素大多属于Na+通道毒素，根据其在钠通道上作用位点的不同分为α型和β型。根据其对昆虫神经突触的影响分为：a）兴奋性毒素，通过抑制Na+通道动作电位的快速失活，延长动作电位，增强Na+峰电流，使昆虫兴奋麻痹死亡；b) 阻抑性毒素，封闭已经产生的动作电位，降低钠离子峰电流，使昆虫软瘫致死[6]。依据作用对象分为哺乳动物神经毒素、甲壳纲类动物神经毒素及昆虫神经毒素，其中，昆虫神经类毒素在农业抗虫害方面有广泛应用。 2、蝎毒素抗昆虫机理 蝎昆虫毒素多肽不仅可作为研究不同离子通道亚型的特异性工具，也可用于门控离子通道作用机制研究[8,9,10]。研究表明 BmK IT- AP、 BmK αIT、 BmK βIT、 Bj- xtrIT、 BmK IT1、 BmK IT2、 BmK IT3、 BmK IT4、 BmK IT等多种蝎毒素多肽均具有抗虫效应。将蝎毒素多肽BmK-IT重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中，发现具有很好的杀虫特异性和安全性[11]。抗昆虫蝎毒素靶向结合于电压门控Na+通道，其中α型昆虫毒素与Na+通道第Ⅲ结构域结合，引起Na+通道动作电位的快速失活，延长动作电位；β型昆虫毒素与Na+通道第Ⅳ结构域结合，改变通道的激活电压，产生超极化，导致动作电位的重复发放。BmK IT1疏水末端通过二硫键连接，遮蔽了部分β2 折叠中loop 环上的疏水基团，进而使其能够特异性的作用于昆虫细胞膜上的Na+通道。蝎毒素多肽 BmK IT2特异性的作用于Na+通道，改变钠电流稳态，引起Na+通道失活，使膜电位向超极化方向移动【12,13】，这可能是其杀虫作用的机制。 3、抗昆虫蝎毒素多肽序列分析比对 通过对BmK IT2、BmK IT3、 BmK IT4、BmK ITa、 BmK ITb、 BmK ITc、BmK IT- AP、BmK ITa2、 BmK ITc2等抗昆虫毒素多肽进行序列比对分析发现，它们的同源性超过了67%，提示抗昆虫蝎神经毒素有相当高的同源性，且同源序列集中在5’端从12到16个氨基酸处，最本质的的差异是反映在分子中4对二硫键,其中3对同源,惟有1对从原在 MTx分子N端处的第1个半胧氨酸残基(大多在第12位),相应地在rrx分子中变 异到了一个内部位置(第38位)上。正是由于这对二硫键的变位导致了ITx在空间分 子构型上的改变,从而在分子水平上合理地解释了ITx相对地只对昆虫,而不对哺 乳动物神经系统具有专一药理作用的特性l9]。在ITx基因的克隆、重组、表达过程 中,有时所表达的ITx没有活性的一个重要原因,就是由于形成了不正确的二硫键配 对和空间折叠价6]。 目前,提交ProteinDataBank的东亚钳蝎毒素有8个X一ray衍射晶体结构(1B7D, IBCqICHZ,ISNI,ISN4,ISNB和ZSN3)和近16个NMR溶液构象,其中BmK MI、M2、M4和MS(ISNI,IC甩,ISN4,15阳)均得到了高分辨率高精度的晶体 结构并得到解析,这为蝎毒素结构与功能的研究提供了依据。现在已有十余个蝎长 链毒素的高级结构被解析出来,其中大部分是哺乳动物毒素。到现在为止