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B-DNA是活性最高的 DNA构象， B-DNA变构成为A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后则活性明显降低。 三种不同构象的DNA活性 变性和复性 变性 概念：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。 常用的变性方法 ☆ 热变性 ☆ 碱变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 核酸变性程度的鉴定——紫外测定法： 原理： 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。 紫外光吸收值： 1 双链DNA A260=1.00 2 单链DNA A260=1.37 3 自由碱基 A260=1.60 1.185 1.0 1.37 OD ℃ Tm = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 熔解曲线与Tm值 缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线。 这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94℃的原因 熔链温度Tm 影响DNA Tm值大小的因素： DNA的均一性： G-C含量： Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41 (G+C)% GC%=（Tm-69.3）×2.44 介质中的离子强度： DNA保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。 复性及杂交 DNA复性 变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火。 DNA的复性的条件有两个： （1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力； （2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高， 一般使用比Tm值低20－25℃ 。 复性的机制 一般认为需要10－20个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。 绝大部分的复性DNA分子都不是原配的。 复性的影响因子： 温度和时间：低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) DNA浓度： DNA片段的大小： DNA顺序的复杂性； 反应溶液中的离子强度。 多聚酶链式反应（ PCR） 是一种DNA体外扩增技术，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 杂交 杂交：亲缘关系很近的不同来源的DNA单链或RNA单链与DNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。 图　核酸杂交及其应用示意图1 粗细线分别代表不同DNA。 杂化双链 B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分,D显示从天然DNA链鼓出小泡. Ⅱ.突变体的鉴别 I 变性、复性和杂交 Ⅲ.分子探针标记 核酸分子探针： 用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知核苷酸序列作为探针，探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，就可以探知核酸分子。 粗线表示分子探针 图　核酸杂交及其应用示意图2 杂交分类： 1）液相杂交：不同来源的DNA在溶液中进行杂交。 2) 滤膜杂交：将DNA或RNA吸附到硝酸纤维素膜上再进行杂交。 Southern杂交：用于鉴别DNA的杂交 Northern杂交：用于鉴别RNA的杂交 Southern 印迹法： DNA 限制片段 限制性内切酶 带有DNA片段的凝胶 琼脂糖凝胶电泳 碱液浸泡，并中和 凝胶上DNA变性 变性的单链DNA转移至硝酸纤维素薄膜上 放射性标记探针杂交 杂交DNA-DNA分子 放射自显影 显示出杂交分子的位置 遗传的物质基础的证明实验 DNA双螺旋结构模型的基本参数 维持DNA双螺旋结构的力 DNA变性、DNA复性、杂交 回顾 羊瘙痒病 1982年，美国发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病，并称为“Prion”即朊病毒。 马鹿和鹿的慢性消瘦病、猫的海绵状脑病。 1996年春天“疯牛病”：牛海绵状脑炎 人慢性退化性紊乱疾病：老年痴呆、帕金森氏病、糖尿病等。 朊病毒引起的风波 致