酶工程-第四章.ppt

第四章 酶的分离与纯化 第一节 酶制剂的制备过程 第二节 酶的分离与提取 第三节 酶的纯化与精制 二、材料预处理 为了获得胞内酶，首先要进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取和纯化。 对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织的细胞，由于细胞外层结构（壁、膜）不同，所采用的细胞破碎方法和条件也有所不同，必须根据具体情况进行选择。 三、初步探索酶的性质 四、制定酶的分离程序 五、酶的纯度检验 作业题 1、试述酶提取的概念及主要方法。 2、酶的常常分享有哪些主要方法？简述其原理和特点。 3、简述膜分离技术在酶生产中的应用。 4、简述各种层析法的原理和操作要点。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 蛋白质透析 透析袋透析简单装置。 A:透析夹，B:透析，C:透析示意图 根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。 膜技术 截留物尺寸nm （分子量） 推动力 分离机理 微滤MF 20 (40,000) 压力差，100kPa 筛分 超滤UF 1～20 (10,000--40,000) 压力差，100kPa 筛分 纳滤NF 1 (100～1000) 压力差，1000kPa 优先吸附、表面电位 反渗透 RO (100) 压力差，1000kPa 优先吸附、溶解扩散 四种常用膜分离技术的基本特征 四种常用膜分离过程的截留特性 本节 目录 五、层析分离 层析分离技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。 它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。 层析法的分类： 流动相：两种状态。 ⑴液体作为流动相；⑵气体作为流动相。 固定相：两种状态。 ⑴固体吸附剂作为固定相； ⑵以吸附在固体上的液体作为固定相。 按两相所处的状态分类： 液相层析 气相层析 液-固层析 液-液层析 气-固层析 气-液层析 按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定的方法。 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 ㈠吸附层析 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。 吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。 层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。 洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法 置换洗脱法 前缘洗脱法 ㈡分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中浓度的比值。 在层析条件确定后，层析系数是一常数。 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。 另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。 当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 常见的有：纸上层析、分配薄层层析、分配气相层析。 ㈢离子交换层析 是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质