培训课件--磁珠分离细胞技术.pptVIP

* 磁珠分选技术 磁珠分选技术 免疫学+细胞生物学+磁力学 基于抗体对抗原的特异性识别：免疫磁珠 磁性微珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连：抗体偶联磁珠、二抗磁珠、生物素磁珠、Oligo dT磁珠 在高强度、梯度磁场中达到磁性分离的目的：分离细胞、蛋白、核酸、细菌等 磁珠 磁力架 分离柱或分离试管 MACS，Dynal，BD，StemCell，RD… 磁珠分选系统 管式分选 Dynalbeads? Dynalbeads 分离试管 磁力架 柱式分选 未标记的细胞先行流出 MACS微珠进行磁性标记 撤去磁场，将标记的细胞洗出 磁性铁珠在分选器作用下形成强大的磁场，使含磁珠的细胞悬浮在磁场中 MACS d≈50nm，多聚糖和氧化铁组成的超顺磁化微粒；可被细胞生物降解而无需解离磁珠；分离丰度极小的细胞(10-8); Dynal d=4.5um﹑2.8um﹑1um，多聚材料包被的氧化铁超顺磁微球；均一性好；也适用于细胞活化； BD d≈200nm，超顺磁化微粒；包被了高质量的BD抗体； StemCell 管式；柱式; RD d≈150nm，链酶亲和素磁珠，类胶体. 直标 间标 抗链酶亲和素磁珠 抗生物素磁珠 抗免疫球蛋白磁珠 抗荧光素磁珠 在没有直接标记微珠可选时 使用自备抗体或配体的磁性分选中 分选或去除用多个抗体混合物标记的多种细胞 分选稀有细胞和抗原弱表达的细胞 间标扩展了分选范围 分选策略 阳性分选 去除分选 多重分选 用磁珠标记目标细胞 目标细胞滞留在分选柱内 目标细胞被洗脱，收集 目的细胞磁性标记后，作为阳性的标记组分直接分选出来。 高纯度，高回收率，操作简单，尤其是富集稀少细胞。 分选前 阴性组分(未滞留在分选柱上的细胞) 阳性组分(滞留在分选柱上的细胞) 应用anti-CD19磁珠分选人外周血中的B细胞 非目的细胞磁性标记后，作为阴性的组分滞留在分选柱上，未标记的目的细胞被分选出来。 去除不需要的细胞 缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞） 不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被刺激（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析） 需进一步通过阳性选择分选细胞亚群。 标记非目的细胞 非目的细胞滞留在分选柱上，被去除 生物素标记CD2, CD14, CD16, CD36, CD43, CD235a; 再加入链酶亲和素标记的磁珠 应用去除法分选人外周血中的B细胞 先去除非目的细胞，再进行阳性分选。 非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原；要分选非常稀有细胞，先去除非目的细胞再行阳性分选，可获得高纯度的目的细胞。 标记去除非目的细胞 标记目的细胞 洗脱目的细胞 应用：分选人外周血中的CD4+CD25+ T细胞 分选前 去除分选后 阳性分选后的阴性组分 阳性分选后的阳性组分 洗脱目标细胞 用标记1标记目标细胞 用标记2标记目标细胞 去除磁珠标记 洗脱目标细胞 进行多次连续阳性分选，进行新标记前先去除原来的磁珠标记。 可进行多参数分选。 应用：分选人外周血中的CD3+CD56+ T细胞 分选前 第一次阳选 第二次阳选 优点：操作简单，高效快捷，无菌和细胞状态更有保证，回收率、纯度高。 缺点：不能在分选的同时进行分析，分选过程中很难去除死细胞团块的干扰，难于同时进行多种标记物的分选。 分选前标本处理 密度梯度离心(Ficoll, Percoll) （根据情况）溶血(溶解红细胞) 过滤(单个细胞) 分选标本：不含有死细胞或者碎片的单细胞悬液 骨髓、外周血、脐带血提取的单个核细胞 处理的组织细胞 培养的细胞 全血*（autoMACS） 选择合适的分选策略！ *