药理学实验总结.doc

流式细胞术 背景：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸又脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。 AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS外翻发生在细胞核破裂，DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。 检测原理：用标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合AnnexinV-FITC。正常细胞核早期凋亡的细胞膜是完整的，Propidium iodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与AnnexinV-FITC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞（FITC阴性）和早期凋亡细胞（FITC阳性）之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 样品染色： 离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心（300g*8min），收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。 用冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽PBS。 用400ul(200ul)1xAnnexinV结合液悬浮细胞，浓度大约1x10*6cells/ml。 在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8度避光条件下孵育15分钟。 加入10ulPI染色液后轻轻混匀于2-8度避光条件下孵育5分钟。 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 注意事项： 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。 细胞处理要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。 AnnexinV-FITC和Propidium iodide(PI)是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。 使用AnnexinV-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与AnnexinV结合。 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1x10*5。 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解AnnexinV-FITC，最终导致染色失败。 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶的消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响AnnexinV与PS的结合。 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对试验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。 有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度极低，难以染色，此时不适合用AnnexinV方法检测凋亡。 细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） 样品预处理： 动物组织： 1、切取5-20mg的动物组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至1.5m